The ELISA postupak može se grubo podijeliti u tri procesa. To su dizajn ELISA protokola, ELISA inicijalna interpretacija podataka i proračun ELISA rezultata.
Katalog: Oprema-Za-Elisa-Kit-Proizvodnja
Dobro osmišljen i savršen ELISA Dizajn eksperimentalnog protokola zahtijeva racionalan raspored različitih eksperimentalnih faktora i strogu kontrolu eksperimentalnih grešaka, čime se izbjegava rasipanje ljudskih, materijalnih i finansijskih resursa uzrokovano slijepim provođenjem eksperimenata.
Obično preporučujemo da se prve dvije kolone 96 mikrotitarske ploče koje se koriste za ELISA eksperimente postave kao standardne jažice za uočavanje, uz postavljanje 8 gradijentnih koncentracija, 2 kolone jažica spojeva i dodavanje standardne radne otopine od niske do visoke koncentracije , uzastopno od dna do vrha standardne ploče za enzime.
Zadnjih 10 kolona mikrotitarske ploče može se postaviti kao jažice za uočavanje uzoraka za uzorke koji se testiraju, i općenito postaviti 2 dupla jažica. Prema eksperimentalnim zahtjevima, može se postaviti normalna grupa, grupa modela, grupa tretmana itd.
preciznost: Preciznost an Enzimski imunosorbentni test odražava reproduktivnost izmjerenih podataka. Preciznost se općenito izražava koeficijentom varijacije CV (CV = standardna devijacija / srednja vrijednost × 100%). Općenito, CV standarda i uzorka OD treba biti ≤ 10%.
OD vrijednost: OD vrijednost prazne bušotine ELISA je ≤ 0.1 (sendvič metoda). Maksimalni OD standarda je ≥1.2. OD uzorka treba da bude unutar opsega standardne krive.
Linearni raspon: R2 ≥ 0.99 za koeficijent korelacije linearne regresije standardne krive.
Kao poslednji korak ELISA eksperiment, proračun rezultata testa je veoma važan za ceo eksperiment.
Uzimamo sendvič metodu kao primjer za uvođenje izračuna rezultata ELISA eksperimenta.
ELISA uzorci obično moraju postaviti 1~2 duplikata bunara za testiranje, a prosječna vrijednost apsorbancije standarda i uzoraka eksperimentalne grupe su izvedeni respektivno. Vrijednost detekcije jednog uzorka ne smije prelaziti 20% prosječne vrijednosti.
Prosječnu vrijednost OD (apsorbancije) ELISA uzoraka treba oduzeti od prosječne vrijednosti OD kada je koncentracija standarda 0.
Uspostavite standardnu krivu: postavite krivu logističke funkcije od četiri parametra na logaritamsku koordinatnu grafiku (standardna koncentracija na X-osi i odgovarajuća vrijednost OD-a na Y-osi). Preporučuje se korištenje originalnog softvera.
Korak 1: Unesite standardnu koncentraciju i vrijednost OD
Korak 2: Odaberite vrstu krive koju želite ugraditi - nelinearno uklapanje krive
Korak 3: Odaberite Statistiku i logistiku, označite "Pronađi X od Y"
Korak 4: Pregledajte informacije standardne krive ELISA (npr. vrijednosti parametara, R-kvadrat, itd.)
Korak 5: Izmijenite naslov horizontalnih i vertikalnih koordinata i postavite tip ose na logaritamski
Dvaput kliknite na ELISA grafikon uklapanja u koraku 4 i uredite ga. Dvaput kliknite na naslov izmijenjenih horizontalnih i vertikalnih koordinata, dvaput kliknite na X-os i Y-os, postavite tip koordinata na "Log10" i postavite horizontalni i vertikalni raspon koordinata.
Korak 6: Izračunajte koncentraciju uzorka iz standardne krive
Odaberite četvrti radni list (Fit NL Find X from Y1), unesite OD vrijednost uzorka u lijevu kolonu, a odgovarajuća koncentracija će se automatski generirati u desnom stupcu.
Prilikom izvođenja ELISA eksperimenata treba savladati barem sljedeće točke.
Osnovni sastav enzimski imunosorbentni test pozitivna kontrola treba da bude ista kao i uzorak uzorka što je više moguće. Općenito, pozitivne kontrole se uglavnom zasnivaju na puferu koji sadrži proteinski zaštitnik i dodaje određenu količinu supstance koja se testira. Na primjer, za određivanje ljudskog seruma kao uzorka, pozitivna kontrola se uglavnom sastoji od određivanja pacijentovog seruma ili spoja kalcijeve ljudske plazme sa određenom količinom standarda.
Osnovni sastav ELISA negativna kontrola također treba biti u skladu sa sastavom ispitnog uzorka koliko god je to moguće, a najbolje je prvo testirati kako bi se utvrdilo da ne sadrži tvar koja se ispituje. Na primjer, kada se testiraju uzorci ljudskog seruma, negativna kontrola treba biti normalan ljudski serum; kada se testira potentnost antitijela u serumu imuniziranih životinja, negativna kontrola treba biti preimuni serum životinje.
Selekcija inkapsuliranih antigena
Inkapsulirani antigeni se mogu podijeliti u tri kategorije: prirodni proteini, rekombinantni proteini i antigeni malih molekula. Prirodni proteini moraju biti pročišćeni da bi bili obloženi metodom direktne adsorpcije, jer se antigeni koji sadrže više nečistoća mogu obložiti metodom indirektnog hvatanja (prva upotreba tvari koje mogu reagirati s ciljnim antigenom kao što su antitijela direktno adsorbirana na standardnoj ploči enzima, i zatim se specifičnom reakcijom napravi čvrsta faza antigena). Pročišćeni rekombinantni proteini općenito mogu biti direktno obloženi. Antigene male molekule kao što su peptidi i neka organska jedinjenja male molekule često je teško adsorbirati direktno na pločicu enzima zbog njihove male molekularne težine i općenito su spojeni s nepovezanim proteinima kao što je BSA, a parovi se adsorbiraju na nosaču čvrste faze.
Izbor rješenja za premazivanje
ELISA rastvor za oblaganje je obično karbonatni pufer pH 9.6 ili fosfatni pufer pH 7.2 ako je antigen nestabilan u alkalnim uslovima.
Odabir temperature oblaganja ELISA
Temperatura ELISA oblaganja je obično 4-8 stepeni Celzijusa preko noći ili 37 stepeni Celzijusa tokom 2 sata, toplo preporučujemo 4-8 stepeni Celzijusa za održavanje aktivnosti proteina.
Odabir ELISA koncentracije premaza
Optimalna koncentracija ELISA prevlake varira u zavisnosti od prirode nosača čvrste faze i prevlake, općenito, koncentracija proteina u prevlaci je 1-5 ug/ml, da bi se specificirala optimalna koncentracija omotača za specifični antigen premaza treba odrediti eksperimentom.
Da li je zatvaranje neophodno zavisi od načina ELISA i specifičnih eksperimentalnih uslova. Uopšteno govoreći, za sendvič test sa dvostrukim antitijelima, sve dok je marker enzima visoko aktivan i operacija je temeljito isprana, zadovoljavajući rezultati se mogu dobiti bez zatvaranja. Nasuprot tome, u indirektnim testovima, zadržavanje je općenito bitno.
Uobičajeni zaptivači su 0.05%-0.5% BSA, 10% teleći serum, 1% želatin i 5% obrano mlijeko u prahu, AbMART preporučuje korištenje 5% obranog mlijeka u prahu, koje je jeftino i ima jaku sposobnost zaptivanja, međutim, 5 % obrano mlijeko u prahu je pogodno samo za kratkotrajnu upotrebu i ne treba ga čuvati dugo vremena, pa se manje koristi u kompletu.
Razblaženja enzimskih konjugata
Visoke koncentracije stranih proteina (npr. 1% BSA ili 5% obranog mlijeka u prahu) se često dodaju u razrjeđivač kako bi se inhibirala nespecifična adsorpcija konjugata enzima na nosaču čvrste faze konkurencijom. Nejonski surfaktant sposoban da inhibira adsorpciju proteina na plastičnoj površini, kao što je Tween 20 (poželjna koncentracija od 0.05%), također se općenito dodaje.
Pravilno razrjeđivanje enzimskih konjugata
Odgovarajuću radnu koncentraciju enzimskog konjugata treba odrediti prethodnim eksperimentima. Previsoka koncentracija dovodi do visoke pozadine, dok će preniska koncentracija dovesti do slabljenja pozitivnog signala.
Konjugat enzima poželjno je razrijediti prije upotrebe, a razrijeđeni enzimski konjugat ne treba čuvati dugo vremena, jer su niske koncentracije konjugata enzima vrlo osjetljive na inaktivaciju.
pitanje | Mogući uzroci | rastvor |
---|---|---|
Negativne kontrole su dale pozitivne rezultate | 1. Kontaminacija reagensa ili potrošnog materijala 2. Problemi sa pranjem tanjira 3. Ako se problem javi u sendvič metodi dvostrukih antitijela, moguće je da postoji unakrsna reakcija između antitijela za oblaganje i sekundarnog antitijela. 4. Upotreba previše antitela | 1. Promjena reagensa, korištenjem zaliha za jednokratnu upotrebu 2. Zamenite rastvor za pranje jačom formulom, povećajte broj pranja tanjira i produžite vreme pranja tanjira. 3. Zamjena obloženog antitijela ili sekundarnog antitijela 4. Smanjite količinu korištenih antitijela. |
Cijela ploča izgleda kao visoka pozadina | 1. Sekundarna antitijela proizvodi nespecifičnu adsorpciju 2. Chromogenic rastvor nije svjež 3. Reakcija razvoja boje se ne prekida predugo 4. Kontaminacija reagensa ili potrošnog materijala 5. Nespecifična adsorpcija zbog visoke temperature reakcije Nespecifična adsorpcija zbog loših uslova zadržavanja | 1. Smanjite količinu korištenog sekundarnog antitijela, skratite vrijeme reakcije sekundarnog antitijela 2. Koristite gotova rješenja za razvoj boja 3. Kontrolišite vrijeme reakcije razvoja boje i na vrijeme prekinete reakciju 4. Promijenite reagense i koristite potrošni materijal za jednokratnu upotrebu 5. Strogo kontrolisati reakciju na optimalnoj temperaturi 6. Zamijenite rješenje za blokiranje snažnijim rješenjem za blokiranje i produžite vrijeme blokiranja |
Nizak signal reakcije | 1. Neodgovarajući uslovi premaza 2 .Neadekvatna reakcija antigena i antitijela 3. Nepravilna formulacija rastvora za razvijanje boje 4. Nedovoljno vezivanje sekundarnog antitela | 1. Povećajte koncentraciju ploče, produžite vrijeme ploče 2. Produžite vrijeme reakcije kako biste osigurali da se reakcija odvija na optimalnoj temperaturi i povećajte količinu kromogenog supstrata 3. Povećajte koncentraciju sekundarnog antitela, produžite vreme reakcije i zamenite sekundarno antitelo efikasnijim. |
Gradijentno razrjeđivanje radi ELISA-e dovodi do fenomena skakaće rupe | 1. Neravnomjeran prijenos topline zbog slaganja enzimskih ploča, razlike u temperaturi reakcije svake jažice 2. Razblaživanje pipetom ne održava kontinuitet 3. Isparavanje reakcionog rastvora 4. Neravnomjerno pranje ploča 5. Na dnu enzimske ploče ima krhotina ili kapljica vode | 1. Izbjegavajte slaganje ploča zajedno što je više moguće 2. Redovno kalibrirajte pipetu kako biste osigurali pravilnu upotrebu pipete 3. Zapečatite ili pokrijte ploče pečatom 4. Proverite da li mašina za pranje ploča radi ispravno i očistite ploče kada čitate |