ELISA esperimentua printzipioa erraza da, urrats gutxiago, prozesu laburra, kit nahiko erraza da funtzionatzen, hasiberri esperimentala erraz has daiteke. Hala ere, esperimentua azkar hasten den arren, ez da hain erraza emaitza esperimental fidagarriak lortzea. Esperimentua hobeto laguntzeko, hemen ELISA kitei buruz arduratuko da eta maiz egiten diren galderak honela antolatuta daude.
katalogoa: Elisa Kit Fabrikaziorako ekipamendua
Gaur egungo ELISA kitak gizakiarentzat, saguarentzat eta arratoiarentzat dira batez ere; adierazle kopuru txiki batek espezie bereziak hartzen ditu, hala nola tximinoa, untxia, txerria eta oilaskoa.
Bada ELISA kit-a puntu zehatz batekin izendatzen da, esan nahi du bereziki espezie honetarako dela; espezierik zehazten ez bada, esan nahi du kit-a unibertsala dela inplikatutako espeziearen barruan (adibidez, gizakia, sagua, arratoia, tximinoa, untxia, etab.). Beste espezie zehatz batzuetarako, jarri harremanetan laguntza teknikoarekin probaren egokitasuna baieztatzeko.
Emaitza esperimentalen zehaztasuna bermatzeko, estandarrak eta laginak hainbat putzutan egitea gomendatzen dugu, baina ez du behartzen ELISA esperimentua egin behar da. hainbat putzu / 3 putzu anitz, bezeroek beren beharrak ezarri ditzakete putzu anitzeko esperimentuaren arabera.
| Markatze Kurba | Sample | Proba daitezkeen lagin kopurua |
|---|---|---|
| Zulo konposaturik ez | Zulo konposaturik ez | 88 |
| Egin zulo konposatua | Zulo konposaturik ez | 80 |
| Zulo konposaturik ez | Egin zulo konposatua | 44 |
| Egin zulo konposatua | Egin zulo konposatua | 40 |
Emaitzen zehaztasuna ziurtatzeko, ez da gomendagarria putzu kopurua murriztea.
Eragiketa urratsak arren ELISA esperimentuak berdinak dira, eragin-faktore ezberdinak aldatuko dira esperimentu bakoitzean. Hori dela eta, esperimentu bakoitzeko kurba estandarra berriro marraztu behar da detekzio emaitza zehatzagoak eta fidagarriagoak lortzeko.
Hainbat esperimentu egin behar badituzu, disolbatu ondoren estandarraren kontzentrazio handiena -20 ℃ baldintzatan gorde daiteke pakete bereizietan izoztea eta desizoztea errepikatu ez dadin, eta hilabete erdian eraginkortasunez erabili.
Erreaktibo klinikoak erakunde autoritarioek onartzen dituzte, hala nola FDA, CFDA, etab.. Ikerketa-erreaktiboak, oro har, fabrikatzaileek beraiek garatzen dituzte eta ez dute erakunde autoritarioek egiaztatu behar.
Diagnostiko klinikoko produktuekin diharduten erakundeek Medical Device Business Enterprise Lizentzia lortu behar dute. Ikerketako erreaktiboek ez dute dokumentu hau behar.
Kit klinikoak, oro har, jariatze-lagin mota bakarra probatzeko erabiltzen dira, hala nola giza serum/plasma. Ikerketa kitek lagin mota eta proba sorta askoz zabalagoa dute kit klinikoak baino. Hala ere, oro har, kit klinikoen kalitatea eta egonkortasuna kit zientifikoak baino hobeak dira.
ELISA kit-ek, BSA proteina babes gisa gehitzea izan ezik, ez dute animalia-jatorriko beste osagairik eta Cartagenako biosegurtasun protokoloaren baldintzak betetzen dituzte. Gainera, kitaren kontserbatzailea proclin 300 da, ez hain toxikoa eta ingurumenarentzat segurua dena.
ELISA kitak kantitate ezberdinetan erabil daitezke. Gure entzima-zerrendak desmuntagarriak dira, beraz, esperimentu bakoitzerako behar duzun tira kopurua eta osagai erreaktibo bakoitzaren edukia zehaztu dezakezu zure behar esperimentalen arabera.
Estandar solubilizatuak kontzentrazio/lote nagusian gordetzea gomendatzen da, zatitu eta -20 °C-tan gordetzea, behin eta berriz izozteak eta desizozteak saihestuz, eta hilabete erdian eraginkortasunez erabiltzea.
Antigorputz biotinilatuen lan-soluzioa eta HRP entzimaren konjugatuaren lan-soluzioa prestatu eta erabili behar dira orain. Erabiltzen ez diren kontzentratuak eta beste osagai batzuk 2 ~ 8 ℃/-20 ℃-tan gorde behar dira, hurrenez hurren, argibideen arabera garaiz, eta 6 hilabetez gorde daitezke.
Seruma: For ELISA probak, odola biltzeko hodi ez-antikoagulatzaileak/prokoagulatzaileak behar dira
(normalean odola biltzeko hodi gorriak, horiak eta laranjak)
Plasma: entzimekin lotutako saiakuntza immunosorbenterako, odol-hodiak antikoagulatzailearekin. (normalean hodi berdeak eta moreak)
ELISA lagina jaso ondoren, astebeteko epean azterketa egiten bada, 1-2 °C-tan gorde daiteke. Ezin bada probatu garaiz, mesedez banatu erabilera bakarreko kantitatean eta izoztu -8 °C-tan (saioa hilabeteko epean) edo -20 °C-tan (saioa 1 hilabeteko epean) behin eta berriz izoztea eta desizoztea saihesteko.
Proba egin aurretik, izoztutako laginak poliki-poliki desizoztu eta Zentrifugazio izozte-desizozte prozesuan sortutako hauspeakinak kentzeko.
Hemolisia hainbat faktore fisikokimikok eta toxinak eragin dezakete. In vitro, hemolisia indarrez astindu mekanikoek, izozte kriogenikoek eta beste eragile batzuek eragin dezakete. Hemolisiak proben emaitzetan duen eragina saihesteko, arreta jarri behar da.
Odola zain barrutik biltzean, ponpaketa-presioa ez da oso altua izan behar.
Aldi berean jasotako odol-kopuruak ez luke txikiegia izan behar.
Bildutako odol osoa ez da indarrez astindu behar.
Zentrifugazio-abiadura ez da oso altua izan behar.
Bildutako odol osoa suero/plasma bihurtu behar da ahalik eta azkarren eta odol osoa ez da izoztu edo desizoztu behar.
Odola biltzeko anestesia behar bada, eragin hemolitikorik gabeko anestesikoak erabili behar dira.
Ehun-laginak: ehunak ehotu ondoren, jarri -80 °C-tan 1 orduz/nitrogeno likidoa 0.5 orduz, gero jarri 30 °C-ko ur-bainu batean astindu apur batekin, azkar desizozteko, eta errepikatu eragiketa 1-2 aldiz. .
Zelulen laginak: izoztu-desizoztu 2-3 aldiz behin eta berriz, goiko eragiketa-urratsen arabera. Mintz-proteinen kasuan, sonikatzea modu egokian egin daiteke, baina sonikapenaren tenperatura eta maiztasuna kontrolatu behar dira.
Laginari proteasaren inhibitzaileak gehitzea gomendatzen da aldez aurretik. PMSF gomendatzen da ohiko kasuetan.
Kitaren detekzio-eremua ez da laginaren analitoaren kontzentrazio-tartearen berdina. Gomendagarria da laginaren analitoaren kontzentrazioa estimatzea esperimentuaren aurretik dagokion literaturaren bidez eta laginaren benetako kontzentrazioa aurre-esperimentuaren bidez zehaztea.
Ohiko lagin motaren kasuan, ELISAren laguntza teknikoa kontsultatu daiteke laginaren diluzio gomendatua lortzeko eta esperimentu aurreko probak antolatzeko.
Laginean neurtu beharreko analitoaren kontzentrazioa altuegia edo baxuegia bada, egin laginaren diluzio edo kontzentrazio egokia.
Laginaren analitoaren kontzentrazioa kitaren detekzio-muga minimoa baino askoz txikiagoa bada, saiakuntzarako kit sentikorrago bat hautatzea gomendatzen da.
Gantz handiko laginak koipea eduki, ez disoluzio homogeneoa, zuzenean laginaren gainean bada, antigenoaren antigorputzaren lotura eragingo du, neurketa balio okerrak eraginez. Abiadura handian (5000×g) zentrifugatzea gomendatzen da lehenik, 10 minutuz utzi, likido argiago baten erdiko geruza hartu, gero berriro zentrifugatu abiadura handian (≥5000×g), erdikoa eta behekoa hartu. likido garbiaren geruza eta probak egiteko erabili.
ELISA kitaren detekzio-tartea ez da laginean probatu beharreko analitoaren kontzentrazio-tartearen baliokidea. Esperimentua egin aurretik, laginaren analitoaren kontzentrazioa kalkulatzea gomendatzen da dagokion literaturatik eta laginaren benetako kontzentrazioa aurre-esperimentuen bidez zehaztea.
Zure ELISA saiakuntza laginak diluzioa behar badu, erreferentziako diluzio-protokoloa honakoa da.
| Diluzio-denborak | Diluzio-programa |
|---|---|
| 100 aldiz diluitzea | Urrats bakarreko diluzioa. Hartu 5μL lagin 495μL estandar eta laginaren diluitzailean eta egin 100 aldiz diluzioa. |
| 1000 aldiz diluitu | Bi urratseko diluzioa. Hartu 5 μL lagin 95 μL estandar eta laginaren diluitzailean eta diluitu 20 aldiz, gero hartu 5 μL 20 aldiz diluitutako laginaren 245 μL estandar eta laginaren diluitzailean eta diluitu 50 aldiz, guztira 1000 aldiz diluitu. |
| 100000 aldiz diluitu | Hiru urrats diluzioa. Hartu 5μL lagina 195μL estandar eta laginaren diluitzailean eta diluitu 40 aldiz, ondoren hartu 5μL 40 aldiz diluitutako laginaren 245μL estandar eta laginaren diluitzailean eta diluitu 50 aldiz, eta, azkenik, hartu 5μL 2000 aldiz diluitutako laginaren 245μL estandarrean. laginaren diluitzailea eta 50 aldiz diluitu, guztira 100000 aldiz diluitzeko. |
Diluzio-pauso bakoitzeko, hartutako likido-bolumena ez da 3 μL baino txikiagoa izan behar eta diluzioak ez du 100 aldiz gainditu behar. Diluzio-pauso bakoitza ondo nahastu behar da.
Origin softwarea edo 4-PL (lau parametroko logistika) eredua duen beste software bat erabiltzea gomendatzen da kurba estandarrera egokitzeko. 4-PL egokitze-metodoak kontzentrazio eta absorbantziaren arteko erlazio lineala zehatzago islatu dezake eta, horrela, laginean neurtu beharreko substantziaren kontzentrazioa zehatzago lor dezake. Bi egokitze metodo hauek ez dira gomendagarriak ELISA estandarrak.
ELISA esperimentuaren emaitzaren kalkuluak kurba estandarraren doikuntza eta laginaren kontzentrazioen kalkulua barne hartzen ditu. Putzu estandarren eta lagin erreplikatuen batez besteko OD balioak kalkulatu ziren, eta putzu hutsen OD balioak kendu ziren zuzenketa-balio gisa. Kontzentrazioa koordenatu horizontal gisa eta OD balioa koordenatu bertikal gisa, lau parametroko funtzio logistikoko kurba estandarra egokitu zen koordenatu logaritmiko bikoitzetan, eta, ondoren, laginaren OD balioa kurba estandarrean ordezkatu zen laginaren kontzentrazio-balioa lortzeko. Lagina neurtu aurretik diluitu bazen, laginaren benetako kontzentrazioa diluzio-faktorearekin biderkatu behar da.
