Fluxu-zitometroa
Zer da fluxu-zitometroa?
Fluxu zitometroa zelulak automatikoki aztertzeko eta ordenatzeko gailua da. Likidoan esekita dauden zelula sakabanatuen parametro biofisiko ETA biokimiko garrantzitsu batzuk azkar neurtu, gorde eta bistaratu ditzake, eta zehaztutako zelula azpimultzoak aurrez hautatutako parametro-barrutiaren arabera sailka ditzake. Fluxu-zitometro gehienak zero bereizmeneko tresnak dira, azido nukleikoen, proteina osoaren eta zelula baten beste adierazleen kopuru osoa neurtu dezaketenak, baina ezin dute zati jakin bateko azido nukleiko edo proteina kopurua identifikatu eta detektatu. Beste era batera esanda, zero xehetasun bereizmena du.
Fluxu-zitometroaren funtzionamendu-printzipioa
FACS fluxu-zitometria
A. Parametroen neurketaren printzipioa
Parametro anitzeko neurketa aldi berean egin daiteke fluxu-zitometria, eta informazioa, batez ere, fluoreszentzia-seinale espezifikoetatik eta fluoreszentziarik gabeko sakabanatze-seinaleetatik dator. Neurketa neurketa-eremuan egiten da, neurketa-eremua deritzona laser izpiaren eta tobera kanporatzen duen fluxu likidoaren ebakidura puntu bertikala da. Fluxu likidoaren erdian dagoen zelula bakar bat neurtzeko eremutik pasatzen denean, laserrak irradiatzen du eta argia espazio osora barreiatzen du 2π-ko angelu solido batekin. Sakabanatutako argiaren uhin-luzera argi intzidentearen uhin-luzera berdina da. Sakabanatutako argiaren intentsitatea eta banaketa espaziala estuki lotuta daude zelularen tamainarekin, morfologiarekin, mintz plasmatikoarekin eta barne egiturarekin, parametro biologiko hauek zelularen propietate optikoekin, hala nola argiaren islapenarekin eta errefrakzioarekin, erlazionatuta daudelako. Kalterik jasan ez duten zelulek argi-dispertsio ezaugarria dute, beraz, sakabanatuta dauden argi-seinale desberdinak erabil daitezke zelula biziak zikindu gabe aztertzeko eta ordenatzeko. Zelula finkoen eta zikinduen argi-seinalea sakabanatuta dagoen zelula bizidunen desberdina da, propietate optiko aldatuengatik. Sakabanatuta dagoen argia ez da soilik zelularen parametroekin erlazionatuta sakabanatze-zentro gisa, baizik eta sakabanatutako argia biltzen den angelu solidoa bezalako faktore abiotikoekin ere.
In fluxu-zitometria neurketa, sakabanatuta dauden bi argi mota erabili ohi dira: a. Aurrerako Angelua (0 Angelu) sakabanaketa (FSC); b. Alboko sakabanaketa (SSC), 90 Angeluko sakabanaketa bezala ere ezaguna. Hemen aipatzen den Angelua laser izpiaren norabidearen eta sakabanatutako argi-seinalea biltzen duen hodi fotobiderkatzailearen norabide axialaren artean gutxi gorabehera eratzen den Angeluari egiten zaio erreferentzia. Orokorrean, angelu aurrerako barreiatutako argiaren intentsitatea zelulen tamainarekin erlazionatuta dago eta zelula-populazio bereko zelulen ebakidura-eremua handitu ahala handitzen da. Bizidun zelula esferikoei buruzko esperimentuek erakusten dute funtsean lineala dela angelu solido txiki baten eremuan zehar-sekzio-eremuaren tamainarekin. Zelulen forma eta orientazio konplexua oso desberdinak izan daitezke, batez ere arreta jarri behar da. Alboko argi sakabanatuaren neurketa batez ere zelularen barne egitura finaren propietate pikorrei buruzko informazioa lortzeko erabiltzen da. Albo-sakabanatutako argia zelularen tamainarekin eta formarekin ere erlazionatuta badago ere, zelula-mintzaren, zitoplasmaren eta mintz nuklearraren errefrakzio-indizearekiko sentikorragoa da, eta erantzun sentikorra ere eman diezaieke partikula handienei. zitoplasma.
Praktikan, tresnak lehenik argi-sakabanaketa seinalea neurtu behar du. Zunda fluoreszenteekin konbinatuta erabiltzen denean, argi-sakabanaketaren analisiak lagin bateko zelula tindatuak eta tindatu gabekoak bereiz ditzake. Argi-sakabanaketaren neurketen erabilera eraginkorrena populazio heterogeneoetatik azpitalde batzuk identifikatzea da. Fluoreszentzia seinaleak bi zati ditu batez ere: a. Fluoreszentzia espontaneoa, hau da, fluoreszentzia tindaketarik gabe, zelulan dauden molekula fluoreszenteen fluoreszentzia argiaren ondoren irradiazio; b. Fluoreszentzia karakteristikoa, hau da, zelulek tindaketaren ondoren igortzen duten fluoreszentzia, argiaren gainean koloratzaile fluoreszentearekin konbinatuta, bere fluoreszentzia intentsitatea ahula da, eta uhin-luzera irradiazio laserraren uhin-luzerarekin alderatuta desberdina da. Autofluoreszentzia seinalea zarata-seinalea da, eta kasu gehienetan fluoreszentzia-seinale espezifikoen bereizketan eta neurketan eragin dezake. Immunozitokimikaren neurketan, seinale-zarata erlazioa nola hobetu da lotura-maila baxuak dituzten antigorputz fluoreszenteetarako gakoa.
Oro har, osagai zelularretan autofluoreszentzia sor dezaketen molekulen edukia zenbat eta handiagoa izan (adibidez, erriboflabina, zitokromoa, etab.), orduan eta indartsuagoa da autofluoreszentzia.
Oro har, zelulen osagaietan autofluoreszentzia sor dezaketen molekulen (adibidez, erriboflabina, zitokromoa, etab.) edukia zenbat eta handiagoa izan, orduan eta indartsuagoa izango da autofluoreszentzia. Zelula hilen eta zelula bizien arteko erlazioa zenbat eta handiagoa izan, orduan eta indartsuagoa izango da autofluoreszentzia. Zelula laginaren zelula distiratsuen proportzioa zenbat eta handiagoa izan, orduan eta indartsuagoa izango da autofluoreszentzia. Autofluoreszentzia interferentzia murrizteko eta seinale-zarata erlazioa hobetzeko neurri nagusiak hauek dira: a. Aukeratu koloratzaile fluoreszente distiratsuak ahalik eta gehien; b. Aukeratu laser egokia eta iragazi sistema optikoa; c. Autofluoreszentziaren atzeko planoaren ekarpena konpentsazio-zirkuitu elektroniko batek konpentsatzen du.
B. Laginen bereizketaren printzipioa
Sailkatzeko funtzioa fluxu-zitometroa zelula-sortzaile batek egiten du. Prozesu orokorra hau da: toberaren zutabe likidoa ur-tanta txikitan banatzen da, zirkuitu logikoak hautatutako parametro jakin baten arabera sailkatuko den ala ez zehazteko, eta, ondoren, karga-zirkuituak hautatutako zelula-tantak kargatzen ditu, kargatutako tantaek zelulak eremu elektrostatikotik zehar eramaten dituzte eta desbideratzen dira, kolektorera erortzen dira; Beste likido batzuk hondakin gisa aspiratzen dira, eta tresna mota batzuek harrapatzeko hodiak ere erabiltzen dituzte sailkatzeko.
Tanta egonkorra kristal piezoelektrikoaren bibrazioarekin sortzen da fluxu-ganberako hamarnaka kHz-ko seinale elektrikoaren eraginpean, eta horrek likido-fluxua uniformeki hautstera behartzen du. Orokorrean, tanten tartea ehunka μm ingurukoa da. f=v/4.5d formula enpiriko esperimentalak ur-tanta egonkorraren oszilazio-seinalearen maiztasuna ematen du. Non v likidoaren fluxuaren abiadura den eta d toberaren zuloaren diametroa den. Ikusten denez, zulo desberdinak erabiltzeak eta fluxu-abiadura aldatzeak sailkapen-efektua alda dezakeela. Eremu elektrostatikoan sailkatutako zelulak dituzten tanten desbideratzea karga-zirkuituaren eta deflexio-plakaren bidez lortzen da. Kargatzeko tentsioa +150V edo -150V izan ohi da; Desbideratze-plaken arteko potentzial-diferentzia milaka voltiokoa da. Kargatze-zirkuituan kargatzeko pultsu-sorgailua zirkuitu logikoak kontrolatzen du, beraz, parametroen zehaztapenetik hautapen logikotik pultsu kargatzera arte atzerapen-aldi bat behar da, normalean hamar ms-koa dena. Atzerapen-denbora zehatza zehaztea da sailkapenaren kalitatea zehazteko gakoa. Desplazamendu-erregistroaren zirkuitu digitala erabiltzen da atzerapena sortzeko. Baldintza zehatzen arabera egoki egokitu daiteke.
Fluxu-zitometroa erabiltzea
Zitometria
A. Proba eta kalibrazioa
Fluxu zitometria kontu handiz egokitu behar da erabili aurretik eta baita erabili bitartean ere, lanaren fidagarritasuna eta optimotasuna bermatzeko. Arazte-elementu nagusiak laser-intentsitatea, likido-fluxuaren abiadura eta neurketa-eremuaren bide optikoa dira.
Laser intentsitatea: Ispiluaren Angelua doitzeaz gain, laser argia nahi den uhin-luzera egokitzeko, beharrezkoa da pantailako espektro-kurba konbinatzea laser-intentsitatearen irteera maximizatzeko.
Fluxu likidoaren abiadura: ebakuntza-mahaiaren pantaila digital baten bidez gainbegiratu daiteke eta gasaren presioa doi daiteke likido-fluxuaren abiadura egonkorra lortzeko.
Neurketa-eremuaren argi-bidearen doikuntza: hau da arazketa-lanaren gakoa. Beharrezkoa da neurketa eremuan likido-fluxua, laser izpia, 90 sakabanaketa neurtzeko sistema fotoelektrikoa perpendikular ortogonala dela eta ebakidura-puntua txikia dela. Oro har, mikroesfera fluoreszente estandarrekin kalibrazioan egin daiteke.
Fluxu-zitometrian neurtutako kantitatea balio erlatiboa da, beraz, beharrezkoa da sistema kalibratu edo kalibratu aurretik edo erabili bitartean, neurketa erlatiboaren bidez erabateko esangura lortu ahal izateko. Hori dela eta, FCMn kalibrazioak funtzio bikoitza du: tresnaren lerrokadura doitzea eta eskalatze kuantitatiboa. ESTANDARRA laginak egonkorra izan behar du, osagai ukigarriaren forma nahiko uniformea eta tamaina esferikoa izan behar du, laginaren sakabanaketa-errendimendua ona da eta ekonomia lortzeko erraza da. Mikrosfera fluoreszente estandarrak lagin estandar ez-biologiko gisa erabiltzen dira eta oilasko globulu gorriak lagin estandar biologiko gisa. Mikroesferak erretxinazko materialez eginak daude eta fluoreszeinaz edo fluoreszeina gabe etiketatuta daude. Erabilitako oilasko odoleko globulu gorrien lagin estandarraren prestaketa prozesua honako hau izan zen: % 3.8ko zitrato edo heparinarekin oilasko odol antikoagulatzailea (antikoagulatzailea: oilasko odola = 1:4) hiru aldiz garbitu zen PBSrekin, eta gero 5 ~ 10ml-rekin nahastu zen. %1.0 glutaraldehidoa eta garbitu oilasko globulu gorriekin garbitu giro-tenperaturan 24 orduz astindu ondoren. Azkenik, berriro PBSarekin garbitu eta hozkailuan gorde zen 4 ℃-tan gero erabiltzeko. Adierazi behar da fluoreszentzia-tibarik gabe, neurtutako argi-seinalea oilaskoaren hemoglobinaren berezko fluoreszentzia dela.
B. Tresnen funtzionamendua eta erabilera
a. Piztu korrontea eta berotu sistema aldez aurretik.
b. Ireki gasaren atalasea, doitu presioa eta lortu likido-fluxuaren abiadura egokia; Piztu argi-iturriaren hozte-sistema.
c. Gehitu ura desionizatua lagin-hodira, eta garbitu tobera-sistema.
d. Kalibrazio-lagin estandarra erabiliz, doitu tresna 0 eta 90eko sakabanaketaren fluoreszentzia-intentsitatea handiena izan dadin, eta aldakuntza-koefizientea minimoa izan dadin, laser-potentziaren, fotobiderkatzaile-hodiaren tentsioaren eta anplifikadore-zirkuituaren irabaziaren arabera.
e. Hautatutako emari-tasa, zelula-kopuruaren neurketa, neurketa-parametroak, etab., lan-baldintza berdinetan lagina eta kontrol-lagina neurtzeko; Aldi berean, hautatu datuak ordenagailuaren pantailan bistaratzeko modua, neurketa-prozesua intuitiboki ulertzeko.
f. Lagina neurtu ondoren, ura desionizatua erabiltzen da fluido-fluxu sistema garbitzeko.
g. Datu esperimentalak ordenagailuaren disko gogorrean gorde direnez (makina batzuek CD-ROM sistema ere badute, beraz, biltegiratze-ahalmena handiagoa da), gasa eta neurketa-gailua itxi eta ordenagailua bakarrik erabil dezakezu datuak prozesatzeko.
h. Inprimatu beharrezko emaitzak.
C. Erabilera eta funtzionamenduan neurriak
a. Fotobiderkatzaile hodiak lan-baldintza egonkorrak behar ditu. Argi indartsuaren eraginpean egon ondoren, "iluntasunera egokitzeko" denbora luzea behar du korronte ilunaren hondoaren zati bat ezabatzeko edo murrizteko funtzionatu aurretik. Jarri arreta, halaber, babes magnetikoari.
b. Argi-iturria ez da denbora gutxian piztu eta itzali behar (normalean ordubete inguru); argi-iturria aldez aurretik berotu behar da eta hozte-sistemak behar bezala funtzionatzen duela ziurtatu.
c. Likido-fluxuaren sistema uneoro leun mantendu behar da burbuilen enbolizazioa saihesteko, eta erabilitako zorro-fluidoa iragazi eta desinfektatu behar da erabili aurretik.
d. Neurketa-objektuaren eraldaketaren arabera, arreta jarri iragazki-sistema egokia eta anplifikadore mota aukeratzerakoan.
e. Neurketa bakoitzerako kontrol-talde baten beharra azpimarratzen da bereziki.
Nola erosi fluxu-zitometroa?
Gurea interesatzen bazaizu Fluxu-zitometroa edo zalantzaren bat baduzu, idatzi e-mail bat info@antiteck.com helbidera, ahalik eta azkarren erantzungo dizugu.