Fluxu-zitometroa

Fluxu zitometroa zelulak automatikoki aztertzeko eta ordenatzeko gailua da. Likidoan esekita dauden zelula sakabanatuen parametro biofisiko ETA biokimiko garrantzitsu batzuk azkar neurtu, gorde eta bistaratu ditzake, eta zehaztutako zelula azpimultzoak aurrez hautatutako parametro-barrutiaren arabera sailka ditzake. Fluxu-zitometro gehienak zero bereizmeneko tresnak dira, azido nukleikoen, proteina osoaren eta zelula baten beste adierazleen kopuru osoa neurtu dezaketenak, baina ezin dute zati jakin bateko azido nukleiko edo proteina kopurua identifikatu eta detektatu. Beste era batera esanda, zero xehetasun bereizmena du.

Parametro anitzeko neurketa aldi berean egin daiteke fluxu-zitometria, eta informazioa, batez ere, fluoreszentzia-seinale espezifikoetatik eta fluoreszentziarik gabeko sakabanatze-seinaleetatik dator. Neurketa neurketa-eremuan egiten da, neurketa-eremua deritzona laser izpiaren eta tobera kanporatzen duen fluxu likidoaren ebakidura puntu bertikala da. Fluxu likidoaren erdian dagoen zelula bakar bat neurtzeko eremutik pasatzen denean, laserrak irradiatzen du eta argia espazio osora barreiatzen du 2π-ko angelu solido batekin. Sakabanatutako argiaren uhin-luzera argi intzidentearen uhin-luzera berdina da. Sakabanatutako argiaren intentsitatea eta banaketa espaziala estuki lotuta daude zelularen tamainarekin, morfologiarekin, mintz plasmatikoarekin eta barne egiturarekin, parametro biologiko hauek zelularen propietate optikoekin, hala nola argiaren islapenarekin eta errefrakzioarekin, erlazionatuta daudelako. Kalterik jasan ez duten zelulek argi-dispertsio ezaugarria dute, beraz, sakabanatuta dauden argi-seinale desberdinak erabil daitezke zelula biziak zikindu gabe aztertzeko eta ordenatzeko. Zelula finkoen eta zikinduen argi-seinalea sakabanatuta dagoen zelula bizidunen desberdina da, propietate optiko aldatuengatik. Sakabanatuta dagoen argia ez da soilik zelularen parametroekin erlazionatuta sakabanatze-zentro gisa, baizik eta sakabanatutako argia biltzen den angelu solidoa bezalako faktore abiotikoekin ere.

In fluxu-zitometria neurketa, sakabanatuta dauden bi argi mota erabili ohi dira: a. Aurrerako Angelua (0 Angelu) sakabanaketa (FSC); b. Alboko sakabanaketa (SSC), 90 Angeluko ​​sakabanaketa bezala ere ezaguna. Hemen aipatzen den Angelua laser izpiaren norabidearen eta sakabanatutako argi-seinalea biltzen duen hodi fotobiderkatzailearen norabide axialaren artean gutxi gorabehera eratzen den Angeluari egiten zaio erreferentzia. Orokorrean, angelu aurrerako barreiatutako argiaren intentsitatea zelulen tamainarekin erlazionatuta dago eta zelula-populazio bereko zelulen ebakidura-eremua handitu ahala handitzen da. Bizidun zelula esferikoei buruzko esperimentuek erakusten dute funtsean lineala dela angelu solido txiki baten eremuan zehar-sekzio-eremuaren tamainarekin. Zelulen forma eta orientazio konplexua oso desberdinak izan daitezke, batez ere arreta jarri behar da. Alboko argi sakabanatuaren neurketa batez ere zelularen barne egitura finaren propietate pikorrei buruzko informazioa lortzeko erabiltzen da. Albo-sakabanatutako argia zelularen tamainarekin eta formarekin ere erlazionatuta badago ere, zelula-mintzaren, zitoplasmaren eta mintz nuklearraren errefrakzio-indizearekiko sentikorragoa da, eta erantzun sentikorra ere eman diezaieke partikula handienei. zitoplasma.

Praktikan, tresnak argia zabaltzeko seinalea neurtu behar du lehenik. Zunda fluoreszenteekin konbinatuta erabiltzen denean, argi-dispertsioaren analisiak lagin bateko zelulak eta zikindu gabekoak bereiz ditzake. Argiaren sakabanaketaren neurketen erabilera eraginkorrena populazio heterogeneoetako zenbait azpitalde identifikatzea da. Fluoreszentzia-seinaleak bi zati ditu batez ere: a. Fluoreszentzia espontaneoa, hau da, fluoreszentzia koloraziorik gabe, argi irradiazioaren ondoren zelularen fluoreszentzia molekularen fluoreszentzia; b. Fluoreszentzia ezaugarria, hau da, tindatu ondoren zelulek igortzen duten fluoreszentzia argiaren gainean koloratzaile fluoreszentearekin konbinatuta, bere fluoreszentzia-intentsitatea ahula da eta uhin-luzera irradiazio-laseraren desberdina da. Autofluoreszentzia-seinalea zarata-seinalea da, eta fluoreszentzia-seinale espezifikoen bereizketa eta neurketa oztopatu dezake kasu gehienetan. Inmunozitokimikaren neurketan, seinale-zarata erlazioa nola hobetu funtsezkoa da lotura-maila baxua duten antigorputz fluoreszenteentzat.

Oro har, osagai zelularretan autofluoreszentzia sor dezaketen molekulen edukia zenbat eta handiagoa izan (adibidez, erriboflabina, zitokromoa, etab.), orduan eta indartsuagoa da autofluoreszentzia.

Oro har, osagai zelularretan autofluoreszentzia sor dezaketen molekulen edukia zenbat eta handiagoa izan (adibidez, erriboflabina, zitokromoa, etab.), orduan eta indartsuagoa da autofluoreszentzia. Zenbat eta handiagoa izan hildako zelulen eta bizidunen arteko erlazioa, orduan eta indartsuagoa da autofluoreszentzia. Zenbat eta handiagoa izan zelula-laginean zelula distiratsuen proportzioa, orduan eta indartsuagoa da autofluoreszentzia. Autofluoreszentzia interferentzia murrizteko eta seinale-zarata erlazioa hobetzeko neurri nagusiak hauek dira: a. Aukeratu koloratzaile fluoreszente distiratsuak ahal den neurrian; b. Aukeratu laser eta iragazki sistema optiko egokia; c. Autofluoreszentziaren hondoko ekarpena konpentsazio elektronikoko zirkuitu baten bidez konpentsatzen da.

Sailkatzeko funtzioa fluxu-zitometroa zelula-sortzaile batek egiten du. Prozesu orokorra hau da: toberaren zutabe likidoa ur-tanta txikitan banatzen da, zirkuitu logikoak hautatutako parametro jakin baten arabera sailkatuko den ala ez zehazteko, eta, ondoren, karga-zirkuituak hautatutako zelula-tantak kargatzen ditu, kargatutako tantaek zelulak eremu elektrostatikotik zehar eramaten dituzte eta desbideratzen dira, kolektorera erortzen dira; Beste likido batzuk hondakin gisa aspiratzen dira, eta tresna mota batzuek harrapatzeko hodiak ere erabiltzen dituzte sailkatzeko.

Tanta egonkorra kristal piezoelektrikoaren bibrazioarekin sortzen da fluxu-ganberako hamarnaka kHz-ko seinale elektrikoaren eraginpean, eta horrek likido-fluxua uniformeki hautstera behartzen du. Orokorrean, tanten tartea ehunka μm ingurukoa da. f=v/4.5d formula enpiriko esperimentalak ur-tanta egonkorraren oszilazio-seinalearen maiztasuna ematen du. Non v likidoaren fluxuaren abiadura den eta d toberaren zuloaren diametroa den. Ikusten denez, zulo desberdinak erabiltzeak eta fluxu-abiadura aldatzeak sailkapen-efektua alda dezakeela. Eremu elektrostatikoan sailkatutako zelulak dituzten tanten desbideratzea karga-zirkuituaren eta deflexio-plakaren bidez lortzen da. Kargatzeko tentsioa +150V edo -150V izan ohi da; Desbideratze-plaken arteko potentzial-diferentzia milaka voltiokoa da. Kargatze-zirkuituan kargatzeko pultsu-sorgailua zirkuitu logikoak kontrolatzen du, beraz, parametroen zehaztapenetik hautapen logikotik pultsu kargatzera arte atzerapen-aldi bat behar da, normalean hamar ms-koa dena. Atzerapen-denbora zehatza zehaztea da sailkapenaren kalitatea zehazteko gakoa. Desplazamendu-erregistroaren zirkuitu digitala erabiltzen da atzerapena sortzeko. Baldintza zehatzen arabera egoki egokitu daiteke.

Fluxu zitometria kontu handiz egokitu behar da erabili aurretik eta baita erabili bitartean ere, lanaren fidagarritasuna eta optimotasuna bermatzeko. Arazte-elementu nagusiak laser-intentsitatea, likido-fluxuaren abiadura eta neurketa-eremuaren bide optikoa dira.

Laser intentsitatea: Ispiluaren Angelua doitzeaz gain, laser argia nahi den uhin-luzera egokitzeko, beharrezkoa da pantailako espektro-kurba konbinatzea laser-intentsitatearen irteera maximizatzeko.

Fluxu likidoaren abiadura: ebakuntza-mahaiaren pantaila digital baten bidez gainbegiratu daiteke eta gasaren presioa doi daiteke likido-fluxuaren abiadura egonkorra lortzeko.

Neurketa-eremuaren argi-bidearen doikuntza: hau da arazketa-lanaren gakoa. Beharrezkoa da neurketa eremuan likido-fluxua, laser izpia, 90 sakabanaketa neurtzeko sistema fotoelektrikoa perpendikular ortogonala dela eta ebakidura-puntua txikia dela. Oro har, mikroesfera fluoreszente estandarrekin kalibrazioan egin daiteke.

Fluxu-zitometrian neurtutako kantitatea balio erlatiboa da, beraz, beharrezkoa da sistema kalibratu edo kalibratu aurretik edo erabili bitartean, neurketa erlatiboaren bidez erabateko esangura lortu ahal izateko. Hori dela eta, FCMn kalibrazioak funtzio bikoitza du: tresnaren lerrokadura doitzea eta eskalatze kuantitatiboa. ESTANDARRA laginak egonkorra izan behar du, osagai ukigarriaren forma nahiko uniformea ​​eta tamaina esferikoa izan behar du, laginaren sakabanaketa-errendimendua ona da eta ekonomia lortzeko erraza da. Mikrosfera fluoreszente estandarrak lagin estandar ez-biologiko gisa erabiltzen dira eta oilasko globulu gorriak lagin estandar biologiko gisa. Mikroesferak erretxinazko materialez eginak daude eta fluoreszeinaz edo fluoreszeina gabe etiketatuta daude. Erabilitako oilasko odoleko globulu gorrien lagin estandarraren prestaketa prozesua honako hau izan zen: % 3.8ko zitrato edo heparinarekin oilasko odol antikoagulatzailea (antikoagulatzailea: oilasko odola = 1:4) hiru aldiz garbitu zen PBSrekin, eta gero 5 ~ 10ml-rekin nahastu zen. %1.0 glutaraldehidoa eta garbitu oilasko globulu gorriekin garbitu giro-tenperaturan 24 orduz astindu ondoren. Azkenik, berriro PBSarekin garbitu eta hozkailuan gorde zen 4 ℃-tan gero erabiltzeko. Adierazi behar da fluoreszentzia-tibarik gabe, neurtutako argi-seinalea oilaskoaren hemoglobinaren berezko fluoreszentzia dela.

a. Piztu eta aurrez berotu sistema.

b. Ireki gasaren atalasea, egokitu presioa eta lortu likidoaren fluxu-abiadura egokia; Piztu argi iturria hozteko sistema.

c. Gehitu ura desionizatua lagin-hodiari, garbitu pita-sistema.

d. Kalibrazio-lagin estandarra erabiliz, egokitu tresna 0 eta 90 sakabanaketaren fluoreszentzia-intentsitatea handiena izan dadin, eta aldakuntza-koefizientea minimoa izan dadin, laser potentziaren, hodi fotobiderkatzailearen tentsioaren eta fotobiderkatzailearen tentsioaren arabera. anplifikadorearen zirkuituaren irabazia.

e. Hautatutako emaria, zelula-zenbakiaren neurketa, neurketa-parametroak, etab., lagina eta kontrol-lagina neurtzeko lan-baldintza berdinetan; Aldi berean, hautatu datuak ordenagailuaren pantailan bistaratzeko modua, neurketa-prozesua intuizioz jabetzeko.

f. Lagina neurtu ondoren, ur deionizatua erabiltzen da fluidoen fluxu-sistema garbitzeko.

g. Datu esperimentalak ordenagailuko disko gogorrean gordeta egon direlako (makina batzuk CD-ROM sistema bat ere badute, beraz biltegiratze-ahalmena handiagoa da), gasa itxi eta neurtzeko gailua eta ordenagailu bat bakarrik erabil dezakezu datuak prozesatzeko.

h. Inprimatu behar diren emaitzak.

a. Hodi fotobiderkatzaileak lan-baldintza egonkorrak behar ditu. Argi indartsuaren eraginpean egon ondoren, "egokitzapen iluna" denbora luzea behar du korronte ilunaren hondoaren zati bat desagerrarazteko edo murrizteko, funtzionatu aurretik. Erreparatu ere blindaje magnetikoari.

b. Argi-iturria ez da itzali eta piztuko denbora gutxian (normalean 1 ordu inguru); Argi iturriaren erabilera aurrez berotu behar da eta arreta jarri hozte-sistema normaltasunez funtzionatzen duela.

c. Fluxu likidoaren sistema leun mantendu behar da edozein unetan burbuilen enbolizazioa saihesteko, eta erabilitako zorroaren fluidoa iragazi eta desinfektatu behar da erabili aurretik.

d. Erreparatu iragazki-sistema egokia eta anplifikadore-mota hautatzean, neurketa-objektuaren eraldaketaren arabera.

e. Neurketa bakoitzerako kontrol talde baten beharrari arreta berezia jartzen zaio.

Gurea interesatzen bazaizu fluxu-zitometroa edo zalantzaren bat baduzu, idatzi mezu elektroniko bat helbide honetara [posta elektroniko bidez babestua], ahalik eta azkarren erantzungo dizugu.