Izozkailu Kutxak

Edukia
1. Zer dira izozkailu-kutxak?
    1.1 Zergatik da garrantzitsua zelula immunologikoak izoztea?
    1.2 Zergatik gordetzen dira zelula immunologikoak izozkailuko kutxetan?
2. Izozkailu-kutxen ezaugarriak
3. Nola egin zelulen kriokontserbazioa?
4. Nola erosi izozkailu-kutxak?

Zelulen kriokontserbazioa zelulak kontserbatzeko metodo nagusietako bat da. Liofilizazio-teknologia erabiliz zelulak -196 °C-tan nitrogeno likidoan kriokontserbatzeko, zelulak hazkuntzatik aldi baterako ken daitezke eta haien zelulen propietateak kontserbatu daitezke, zelulak esperimentuak egiteko beharrezkoa denean. Honek zelulak galtzea ekiditen du kulturan dauden zelulen kutsaduragatik edo ustekabeko beste gertakari batzuengatik eta zelulak kontserbatzeko agente gisa ere balio du. Zelulak babes-agente gehigarririk gabe zuzenean izozten direnean, izotz-kristalak sortzen dira urarekin bai zelulen barruan, bai kanpo-ingurunean, eta horrek kalte mekanikoak, elektrolitoak altxatuak, presio osmotiko aldaketak, deshidratazioa, PH aldaketak, proteinen desnaturalizazioa ekar ditzake. etab., zelularen heriotza eragin dezaketenak. Hori dela eta, izoztean eta biltegiratzean, babes-agenteak gehitu behar zaizkio kultura-soluzioari, izozte-puntua jaisteko. Izozte moteleko baldintzetan, zelula barneko ura zeluletatik irten daiteke izoztu aurretik. Nitrogeno likidoan biltegiratzeak izotz-kristalen sorrera murrizten du. Puntu honetan, izozkailu-kutxak aukera ona dira.

Zelula biltegiratzea giza ehunetatik edo odoletatik zelulak erauztea da, baliabide tekniko berezien bidez, zuzenean isolatuta eta araztuta edo in vitro kultura eta anplifikazioa egin ondoren, nitrogeno likidoaren ingurunean -196 ℃-tan gordeta. Tenperatura oso baxuko ingurune honetan, zelulen barruko erreakzio biokimiko guztiak gelditzen dira eta hazkuntza-egoeratik aldi baterako kentzen dira, eta zelulen funtzioa eta jarduera ez dira nabarmen eragiten, eta haien kontserbazio-denbora 20 urte baino gehiago irits daiteke.

Gaur egun, zelulak biltegiratzeko erabili ohi diren bi zelula mota nagusiak zelula amak eta zelula immunologikoak dira. Horien artean, zelula amek honako hauek dira: odol hematopoietikoak hematopoetikoak, zilbor-hesteko zelula amak, plazentako zelula amak, adipo-zelula amak, endometrioko zelula amak, hortz-mamiaren zelula amak, etab. immunitate-zelulek odol periferikoko zelula immunologikoak eta zilbor-hestearen odoleko zelula immunologikoak dira.

Gaur egun minbiziaren intzidentzia handia izanik, zelula immunologikoak gordetzea bizitza salbatzeko neurri bat da minbizia izateko arriskua murrizteko eta lehenik eta behin gerta ez dadin.

Immunitate-organoak adinarekin murrizten dira. Adibiderik nabarmenena timo-guruina da, pubertaroaren ondoren endekatzen hasten dena, T zelulak gutxitzea eraginez. Japoniako Tokioko Zientzia Unibertsitateko Ryo Yasube irakasleak, immunologia aspalditik ikertzen duena, esan zuen: "Immunitatearen gainbeheraren arrazoirik handiena adinaren igoera da". Gorputzaren immunitatea 20 urterekin gorenera iritsi ondoren, sistema immunologikoa pixkanaka beherantz doa adinarekin; 40 urterekin, immunitatea bere gailurraren 1/2 baino ez da, eta 70 urterekin, gailurraren 1/10 baino ez da. immunitate-zelulak gordetzeak immunitate-sistemaren gainbeheraren prozesuan esku hartzen laguntzen du.

Gaixotasun askoren garapena sistema immunearen gainbeherarekin oso lotuta dago. Zahartzaroan immunitate-sistemaren gainbehera dela eta, adinekoek immunoeskasiaren gaixotasunak izateko joera dute, hala nola infekzioak, gaixotasun autoimmuneak eta minbizia. Hori dela eta, jakintsu batzuek zahartzea "gaixotasun immune epidemikotzat" jotzen dute. Immunitate-sistemaren gainbeheraren ondorio larrietako bat da "begi zaharrek" ehun edo zelula normalak etsaiarekin nahasten dituztela eta ehun horiei eraso egiten dietela, hantura eta kalteak eraginez, gaixotasun autoimmuneak eraginez, hala nola artritis erreumatoidea eta lupus eritematoso sistemikoa. Immunitate-zelulak uneoro gordetzeak eta sistema immunologikoa "hornitzeak" sistema immunologikoaren gainbeherak eragindako gaixotasun hauek saihesten lagun dezake.

Zientzialariek aurkitu dute funtzio immunearen gainbehera gizakiaren zahartzearekin lotuta dagoela, eta horrela, zahartzearen teoria immunea proposatu dute. Immunitate-sistemaren funtzioa gutxitzen doa adinarekin, eta zahartzarora iristen denean, ezin du antzematen gorputzeko zeluletan edo molekulen aldaketa sotilak, eta ahal badu ere, ezin du erantzun immunea mobilizatu horiek eraginkortasunez kentzeko. Ondorioz, zelula gaiztoen intzidentzia handitzen da zahartzaroan. Horrez gain, funtzio immunearen gainbeherak sistema immunologikoaren estimulazio-efektua ahultzea dakar nerbio- eta endokrino-sisteman, eta, ondorioz, nerbio-zelulen murrizketa, memoria-galera, erantzun motelagoa, estres-funtzioa murriztea eta atrofia eta funtzio murriztea dakar. gizonezkoen barrabilak eta emakumezkoen obulutegiak, gizakiaren zahartzearen beste seinale batzuen artean. Immunitate-zelulak gordetzen ditu, behar denean berritzen ditu, funtzio immunea hobetzen du, zelula gaiztoak, zelula zaharberritzaileak eta zelula hilak hil eta kentzen ditu, eta horrela lortzen du zahartzearen aurkako helburua.

Odol periferikoko zelula immunologikoak biltegiratzeko odol bilketa bakarra 150-200 ml-koa da, oro har, osagaien bereizketa eta arazketa ondoren, batez ere linfozitoak, monozito eta granulozito kopuru txiki bat, etab., %80 inguruko batez besteko berreskuratze-tasa, gizaki arrunta. linfozitoak, oro har, 1 × 10^6 ~ 2 × 10^6 / ml dira, beraz, azken zelula immuneak 1.5 × 10^8 ~ 3 × 10^8 8 inguru isolatu daitezke, hau da, 1.6 × 10^7 eta 3.3 × artean. 10^7 zelula hodi izozteko zehaztapen bakoitzeko.

Gaur egungo zelula immuneen teknologiaren aplikazioen artean CIK, NK, NKT, CTL, CAR-T, CAR-NK, etab. daude nagusiki. Aplikazio bakarrerako beharrezkoa den zelula kopurua 30 milioi ingurukoa da, hau da, aplikazio-hodi kopurua 1etik 2era bitartekoa da. 9. 3 hodi zelula-kulturaren aplikazioa guztiz bete dezakete tratamendu ikastaro baten 4 eta XNUMX aldiz.

Zelulak dituzten hodi liofilizatuak ezin dira zuzenean nitrogeno likidoan sartu eta tartean eta euskarri gailu bat behar dute tartean - a izozkailu kutxa. -ren eredu konbentzionala liofilizazio kasetea 9 × 9 kaxa karratu bat da, non 9 zelula-hodi lagin baterako zutabe bati dagozkion, eta hori ere komenigarria da etorkizuneko kudeaketa eta erabilerarako.

Liofilizazio-hodi bakar baten ahalmena finkoa da, eta liofilizazio-hodi gutxiegiak hodi bakarrean zelula gehiegi ekar ditzakete zelula kopurua aplikatzen denean zelula-hondakinak eragiten dituenean, eta liofilizazio-dentsitate handiegia duten zelulak egoera kaskarrean daude. suspertu ondoren eta zelulen aplikazio kopurua murrizten da. Liofilizazio-hodi gehiegik berriro ere hodi bakarreko zelula kopurua ez da nahikoa aplikaziorako, eta, beraz, bizkortze anitzak behar dira, eta liofilizazio-soluzio gehiegik berreskurapen txikiagoa eta zelulen hondakinak ere ekarriko ditu. Aldi berean, liofilizazio-hodi gehiegi ukitu gehiegi esan nahi du, eta horrek kutsadura-arriskua areagotu ohi du suspertze-eragiketetan. Horregatik, hobe da suspertze bakoitzeko 1-2 hodi aplikatzea eta zelulak guztiz aprobetxatzea.

a. Zure laginak seguru mantentzea

b. Laginen kudeaketa automatizatua

c. Harrapaketa erraza

d. Aukera erosoagoak

e. Erabiltzeko erraza

f. Alkoholik eta beste substantzia likidorik gabe

g. Kostu txikiagoa alkoholean oinarritutako liofilizazio ekipoekin alderatuta

h. Zelula berreskuratzeko ratio eta zelulen bideragarritasun handiagoa

i. Erreproduzigarritasun ona

j. Erabiltzeko erraza, funtzionamendua normalizatzeko erraza

k. Material desberdinak, hala nola, plastikozko eta paperezko liofilizazio-kutxak epe luzerako edo epe laburrerako biltegiratzeko.

l. Kokapen-identifikazioa liofilizatutako kutxa guztien estalkian.

m. -196 °C eta +121 °C arteko tenperatura tartean erabili daitezkeen plastikozko kaxak.

n. Tabikeak eta aireztapen-zuloak liofilizazio-kutxa kasetearen behealdean likido-irteerarako eta aire-zirkulaziorako.

o. Eman hainbat zehaztapen, hala nola 81 zulo 2 hazbeteko, 100 zulo 2 hazbeteko, etab.

Zelulen kriokontserbazioa zelulak tenperatura baxuko ingurune batean gordetzeko teknika bat da, zelulen metabolismoa murrizteko eta epe luzerako biltegiratzea lortzeko. Zelula-lerro gehienetan, zelulek aldaketak pilatzen dituzte zahartzen eta eboluzionatzen doazen heinean, eta, ondorioz, fenotipiko eta genotipikoaren "kultura-noraeza" sortzen da, eta izozte-prozesuan manipulazio egokiak eta izozte-baldintza egokiak ezaugarri zelularren aldaketa edo galera murriztu dezakete eta zelulen kontserbazio gisa balio dezakete. tresna. Beraz, izozte egokiak eta arrakastatsuak oso garrantzitsua da zelulen epe luzerako aplikazioan.

Zelulek hazkuntza-egoera optimoan egon behar dute (fase logaritmikoan edo esponentzialean) liofilizazioa baino lehen, eta, hoberena, euskarria aldatu egin behar da uzta baino 24 ordu lehenago. Gomendagarria da kulturak mikrobioen kutsatzaileen azterketa egitea, batez ere mikoplasma, zelulak kutsadurarik gabe daudela ziurtatzeko. Zelulak biltzean, manipulazio esperimentalak ahalik eta leunenak izan behar dira zelulen kalteak ekiditeko.

Gaur egun, zelulen kriokontserbaziorako gehien erabiltzen den teknika nitrogeno likidoaren kriokontserbazioa da, batez ere izozteko metodo motela erabiltzen duena babes-agente kopuru egoki batekin zelulak izozteko eta izozte-prozesuan zelulen kalteak murrizteko. Zelulak babes-agenterik gabe zuzenean izozten direnean, zelulen barruko eta kanpoaldeko urak izotz kristalak azkar sortuko ditu, eta horrek erreakzio kaltegarri batzuk eragingo ditu.

Polivinilpirrolidona, etilenglikola, metanola eta metil azetamida kriobabesleak dira. Zelulen kriokontserbazioan ohikoena dimetil sulfoxidoa (DMSO) eta glizerola dira, biak pisu molekular txikiak, disolbagarritasun handia, zelulak erraz sartzen dira, izozte-puntua jaisten dute, zelulen mintzen urarekiko iragazkortasuna hobetzen dute eta, batez ere, ez dira nabarmen. zelulentzat toxikoa. DMSOren ohiko kontzentrazioa % 5 - 10ekoa da (v/v), eta kontzentrazio optimoa zelula-lerroaren arabera aldatzen da. Izozteko medioan glizerolaren azken kontzentrazioa % 5 - 15 da, berriro ere, kontzentrazio optimoa zelula-lerroaren araberakoa da. Zailagoak diren zelulen biziraupena hobetzeko, kontserbatzeko medioan serumaren kontzentrazioa handitu daiteke izoztean. Zelula kriokontserbazio azkarrago eta egonkorragorako, zelulen kriokontserbazio irtenbide bat aukera ona izango litzateke. Ez da prestaketarik behar, kriokontserbazio-soluzio kantitate egokia gehitu zelulei zuzenean, eta bideragarritasun handiko zelulak izan ditzakezu eragiketa sinple batekin.

Izozte motela oso garrantzitsua da zelulen bideragarritasuna berreskuratzeko. Animalia-zelula gehienentzat, minutuko -1 eta -3 °C arteko jaitsierak zelulak izoztutako egoerara hobeto moldatuko dira. Gaur egun laborategi gehienetan erabiltzen den metodo arrunta gradientea hoztea da: 30 min 4 °C-tan, gero -20 °C 2 orduz, eta ondoren, gauean izoztea -80 °C hozkailuan, eta hodiak nitrogeno likidoko depositu batera transferitzea hurrengoan. epe luzerako biltegiratzeko eguna. Zelula liofilizazio-kasete berrerabilgarri batek zelulak behin eta berriz transferitzeko denbora aurreztu dezake prestatutako zelulen liofilizazio-hodiak kasetean sartuz eta nitrogeno likidoko depositu batera transferituz gaua -80 °C-tan zuzenean. Erabilitako liofilizazio-metodoa edozein dela ere, garrantzitsua da biltegiratze-lekuaren transferentzia azkar egin behar dela, eta liofilizazio-hodiak izotz lehorrean jartzea gomendatzen da tenperatura konstantean tenperatura-aldaketek zelulen bideragarritasunean duten eragina saihesteko. transferentzia.

Zelula-tenperatura beti mantendu behar da -130 °C-tik behera bizirik irauteko. Biltegiratze-tenperatura ondo kontrolatzen ez bada, biziraupen-tasa gutxituko da denborarekin. Gomendagarria da zelulak nitrogeno likidoaren baldintzetan gordetzea denbora luzez. Nitrogeno likidoaren deposituaren estankotasuna eta nitrogeno likidoaren bolumenaren egokitasuna eskuz egiaztatu behar dira aldian-aldian, biltegiratze baldintzen ondorioz zelulak kaltetu ez daitezen.

Gurea interesatzen bazaizu izozkailu-kutxak edo zalantzaren bat baduzu, idatzi mezu elektroniko bat helbide honetara [posta elektroniko bidez babestua], ahalik eta azkarren erantzungo dizugu.