The ELISA prozedura gutxi gorabehera hiru prozesutan bana daiteke. Hauek dira ELISA protokoloaren diseinua, ELISAren hasierako datuen interpretazioa eta ELISA emaitzen kalkulua.
katalogoa: Ekipamendua-Elisa-Kit-ekoizpena
Ondo pentsatua eta perfektua ELISA Protokolo esperimentalaren diseinuak hainbat faktore esperimentalen antolamendu arrazionala eta akats esperimentalen kontrol zorrotza eskatzen du, horrela esperimentuak itsu-itsuan egiteak eragindako giza, material eta baliabide ekonomikoak xahutzea saihestuz.
Normalean, gomendatzen dugu ELISA esperimentuetarako erabiltzen den 96 mikrotitulazioko plakaren lehenengo bi zutabeak spotting putzu estandar gisa konfiguratzea, 8 gradiente-kontzentrazio, 2 zutabe konposatuen putzu eta lan-soluzio estandarra kontzentrazio baxutik handietara gehitzea. , sekuentzialki entzimaren plaka estandarraren behetik goialdera.
Mikrotitulazio-plakaren azken 10 zutabeak probatu beharreko laginetarako laginak antzemateko putzu gisa konfigura daitezke, eta, oro har, 2 putzu bikoiztu ezarri. Baldintza esperimentalen arabera, talde normala, eredu-taldea, tratamendu-taldea eta abar ezarri daitezke.
Zehaztasun: Anen zehaztasuna Entzimekin lotutako immunosorbatzaileen saiakuntza neurtutako datuen errepikagarritasuna islatzen du. Doitasuna, oro har, CV aldakuntza-koefizientearen bidez adierazten da (CV = desbideratze estandarra / batez bestekoa × % 100). Oro har, bai estandarraren eta bai laginaren ODaren CVak % 10ekoa izan behar du.
OD balioa: -ren putzu hutsaren OD balioa ELISA ≤ 0.1 da (ogitarteko metodoa). Estandarraren OD maximoa ≥1.2 da. Laginaren OD-ak kurba estandarraren barrutian egon behar du.
Barruti lineala: R2 ≥ 0.99 kurba estandarraren erregresio linealaren korrelazio-koefizienterako.
Azken urrats gisa ELISA esperimentua, saiaketaren emaitzen kalkulua oso garrantzitsua da esperimentu osorako.
Ogitarteko metodoa hartzen dugu adibide gisa ELISA esperimentuaren emaitzaren kalkulua aurkezteko.
ELISA laginek normalean 1 ~ 2 putzu bikoiztu ezarri behar dituzte probak egiteko, eta estandarren eta talde esperimentalen laginen xurgapenaren batez besteko balioa ateratzen da, hurrenez hurren. Lagin bakar baten detekzio-balioak ez du batez besteko balioaren %20tik gorakoa izan behar.
ELISA laginen ODaren batez besteko balioa (xurgantzia) ODaren batez besteko baliotik kendu behar da estandarraren kontzentrazioa 0 denean.
Ezarri kurba estandarra: egokitu lau parametroko funtzio logistikoko kurba koordenatu logaritmikoko grafiko batean (kontzentrazio estandarra X ardatzean eta dagokion OD balioa Y ardatzean). Jatorrizko softwarea erabiltzea gomendatu.
1. urratsa: Sartu kontzentrazio estandarra eta OD balioa
2. urratsa: hautatu egokitu beharreko kurba mota - lineala ez den kurba egokitzea
3. urratsa: Hautatu Estatistikak eta Logistika, egiaztatu "Bilatu X-tik Y"
4. urratsa: Ikusi ELISA kurba estandarraren informazioa (adibidez, parametroen balioak, R-karratua, etab.)
5. urratsa: aldatu koordenatu horizontal eta bertikalen izenburua eta ezarri ardatz mota logaritmikoa
Egin klik bikoitza ELISA fit grafikoan 4. urratsean eta editatu. Egin klik bikoitza aldatutako koordenatu horizontal eta bertikalen izenburuan, egin klik bikoitza X ardatzean eta Y ardatzean, ezarri koordenatu mota "Log10" gisa eta ezarri koordenatu horizontal eta bertikalean.
6. urratsa: Kalkulatu laginaren kontzentrazioa kurba estandarraren arabera
Hautatu laugarren lan-orria (Fit NL Find X from Y1), idatzi laginaren OD balioa ezkerreko zutabean, eta dagokion kontzentrazioa automatikoki sortuko da eskuineko zutabean.
Gutxienez honako puntu hauek menperatu behar dira ELISA esperimentuak egitean.
Oinarrizko osaera entzimekin lotutako immunosorbent-ensayoa kontrol positiboa entsegu-laginaren berdina izan behar du ahal den neurrian. Oro har, kontrol positiboak proteina babesle bat duen eta probatu beharreko substantzia kopuru jakin bat gehitzen duen buffer batean oinarritzen dira gehienetan. Adibidez, giza seruma ale gisa zehazteko, kontrol positiboa pazientearen seruma edo kaltziozko giza plasma konposatua estandar kopuru jakin batekin zehazten da gehienbat.
Oinarrizko osaera ELISA kontrol negatiboa proba-laginaren osaerarekin ere koherentea izan behar du ahal den neurrian, eta hobe da proba egitea lehenik probatu beharreko substantziarik ez duela egiaztatzeko. Adibidez, giza serum-aleak probatzean, kontrol negatiboa giza serum normala izan behar du; immunizatutako animalien serumean antigorputzen potentzia probatzean, kontrol negatiboa animaliaren preimmune seruma izan behar du.
Kapsulatutako antigenoen hautaketa
Kapsulatutako antigenoak hiru kategoriatan bana daitezke: proteina naturalak, proteina birkonbinatzaileak eta molekula txikiko antigenoak. Proteina naturalak xurgatze zuzeneko metodoaren bidez estaltzeko purifikatu behar dira, ezpurutasun gehiago duten antigenoak zeharkako harrapaketa metodoaren bidez estali daitezkeelako (lehen erabili xede-antigenoarekin erreakzionatu dezaketen substantziak, hala nola entzima-plaka estandarrean zuzenean xurgatutako antigorputzak, eta ondoren, antigenoaren fase solidoa egin erreakzio espezifikoz). Proteina birkonbinatzaile araztuak, oro har, zuzenean estali daitezke. Molekula txikiko antigenoak, hala nola, peptidoak eta molekula txikiko konposatu organiko batzuk, askotan zailak dira entzimaren plakan zuzenean xurgatzea, pisu molekular txikiagatik eta, oro har, BSA bezalako proteina batzuekin lotzen dira, eta bikoteak fase solidoko garraiatzailean xurgatzen dira.
Estaldura-soluzioa aukeratzea
ELISA estaldura-soluzioa 9.6 pH-ko karbonato-buffer bat izan ohi da, edo 7.2 pH-ko fosfato-buffer bat baldin eta antigenoa ezegonkorra bada baldintza alkalinoetan.
ELISA estaldura-tenperatura hautatzea
ELISA estalduraren tenperatura 4-8 gradu Celsius izan ohi da gau osoan edo 37 gradu Celsius 2 orduz, 4-8 gradu Celsius gomendatzen dugu proteinen jarduera mantentzeko.
ELISA estalduraren kontzentrazioa hautatzea
ELISA estalduraren kontzentrazio optimoa fase solidoko eramailearen eta estalduraren izaeraren arabera aldatzen da, oro har, proteinaren estaldura-kontzentrazioa 1-5ug/ml da, estaldura-antigeno zehatz baterako estaldura-kontzentrazio optimoa zehazteko esperimentu bidez zehaztu behar da.
Itxiera beharrezkoa den ELISA moduaren eta baldintza esperimental zehatzen araberakoa da. Oro har, antigorputz bikoitzeko ogitarteko saiakuntzarako, entzima-markatzailea oso aktiboa bada eta eragiketa ondo garbitzen bada, emaitza onak lor daitezke itxi gabe. Aitzitik, zeharkako saiakuntzetan, eustea ezinbestekoa da orokorrean.
Erabiltzen diren zigilatzaileak % 0.05-% 0.5 BSA, % 10 txahal-seruma, % 1 gelatina eta % 5 esne-hautsa dira, AbMART-ek % 5eko esne-hautsa erabiltzea gomendatzen du, merkea dena eta zigilatzeko gaitasun handia duena, hala ere 5. % esne-hautsa epe laburreko erabilerarako egokia da eta ez da denbora luzez gorde behar, beraz, kitean gutxiago erabiltzen da.
Entzima-konjokatuen diluzioak
Atzerriko proteina-kontzentrazio handiak (adibidez, % 1 BSA edo % 5 esne-hauts gaingabetua) gehitzen zaizkio sarri diluitzaileari, lehiaren bidez fase solidoko garraiatzailean entzima konjokatuen adsortzio ez-espezifikoa galarazteko. Plastikozko gainazalean proteinen adsortzioa inhibitzeko gai den surfaktante ez-ioniko bat ere gehitzen da, hala nola Tween 20 (% 0.05eko kontzentrazioa hobesten da).
Entzima-konjugatuen diluzio egokia
Entzima konjukatuaren lan-kontzentrazio egokia aurre-esperimentuen bidez zehaztu behar da. Kontzentrazio altuegiak hondo altua ekarri ohi du, kontzentrazio baxuak seinale positiboa ahultzea ekarriko du.
Entzima-konjokatua hobe da erabili aurretik diluitu behar da, eta diluitutako entzima-konjokatua ez da denbora luzez gorde behar, entzima-konjokatuaren kontzentrazio baxuak inaktibatzeko oso sustentsa baitaude.
| Galdera | Arazo posibleak | Irtenbidea |
|---|---|---|
| Kontrol negatiboek emaitza positiboak eman zituzten | 1. Erreaktiboak edo kontsumigarriak kutsatzea 2. Platerak garbitzeko arazoak 3. Arazoa antigorputz bikoitzeko sandwich metodoan gertatzen bada, baliteke estalduraren antigorputzaren eta bigarren mailako antigorputzaren arteko erreakzio gurutzatua egotea. 4. Antigorputz gehiegi erabiltzea | 1. Erreaktiboak aldatzea, botatzeko eta botatzeko tresnak erabiliz 2. Aldatu garbiketa-soluzioa formula indartsuagoarekin, handitu plaka garbitzeko kopurua eta luzatu plaka garbitzeko denbora. 3. Estalitako antigorputza edo bigarren mailako antigorputza ordezkatzea 4. Erabilitako antigorputzen kopurua murriztu. |
| Arbel osoa atzealde altua agertzen da | 1. Bigarren mailako antigorputzak adsortzio ez-espezifikoa sortzen du 2. Soluzio kromogenikoa ez da freskoa 3. Kolorearen garapen-erreakzioa ez da denbora gehiegi amaitzen 4. Erreaktiboak edo kontsumigarriak kutsatzea 5. Adsortzio ez-espezifikoa erreakzio tenperatura altuagatik Adsortzio ez-espezifikoa edukitze-baldintza txarretan dela eta | 1. Murriztu bigarren mailako antigorputz kopurua, laburtu bigarren mailako antigorputzaren erreakzio-denbora 2. Erabili prest egindako kolorea garatzeko irtenbidea 3. Kontrolatu kolorearen garapenaren erreakzio-denbora, eta amaitu erreakzioa denboran 4. Aldatu erreaktiboak eta erabili eta botatzeko kontsumigarriak 5. Zorrotz kontrolatu erreakzioa tenperatura optimoan 6. Ordeztu blokeatzeko irtenbidea blokeatzeko irtenbide indartsuago batekin eta luzatu blokeatzeko denbora |
| Erreakzio seinale baxua | 1. Estaldura-baldintza desegokiak 2 .Antigenoaren eta antigorputzaren erreakzio desegokia 3. Kolorea garatzeko soluzioaren formulazio desegokia 4. Bigarren mailako antigorputz lotze nahikoa | 1. Plakaren kontzentrazioa handitu, plakaren denbora luzatu 2. Luzatu erreakzio-denbora erreakzioa tenperatura optimoan egiten dela ziurtatzeko eta substratu kromogenikoaren kopurua handitzeko 3. Handitu bigarren mailako antigorputzaren kontzentrazioa, luzatu erreakzio-denbora eta ordezkatu bigarren mailako antigorputz eraginkorrago batekin. |
| ELISA egiteko gradientearen diluzioak zulo-jauziaren fenomenoa sortzen du | 1. Bero transferentzia irregularra entzima-plakak pilatzearen ondorioz, putzu bakoitzaren erreakzio-tenperaturaren desberdintasunak 2. Pipeta diluitzeak ez du jarraitutasuna mantentzen 3. Erreakzio-disoluzioaren lurrunketa 4. Plateraren garbiketa irregularra 5. Entzimaren plakaren behealdean hondakinak edo ur tantak daude | 1. Saihestu plakak elkarrekin pilatzea ahal den neurrian 2. Kalibratu pipeta aldizka, pipeta behar bezala erabiltzeko 3. Zigilatu edo estali plakak zigilu batekin 4. Ziurtatu plaka-garbigailuak ondo funtzionatzen duela eta garbitu plakak irakurtzerakoan |
