PCR plaka

Edukia
1. Zer da PCR plaka?
    1.1 Zer da PCR?
        1.1.1 Lehen belaunaldiko PCR
        1.1.2 Bigarren belaunaldiko PCR
        1.1.3 Hiru belaunaldiko PCR
2. PCR plaka motak
    2.1 96 putzuko PCR plaka
    2.2 384 putzuko PCR plaka
    2.3 Gonarik gabeko PCR plaka
    2.4 PCR plaka erdi-gona
    2.5 PCR plaka osoa
3. Nola aukeratu PCR plaka?
    3.1 Zergatik egin ohi dira PCR kontsumigarriak PPz?
    3.2 Nola aukeratu PCR hodi/plaken bolumen ezberdinen artean?
    3.3 Zergatik daude PCR plaka batzuk lauz estalita baina beste batzuk ganbil?
    3.4 Nola aukeratu PCR plaken koloreak?
4. Nola erosi PCR plaka?

PCR plaka eramaile moduko bat da Polimerasaren Kate Erreakzioa (PCR) bezalako primerak eramatea Taq DNA polimerasa, dNTP, azido nukleiko txantiloia, Mg, buffer, etab., PCRko anplifikazio-erreakzioetan parte hartzen dutenak batez ere.

PCR plakak asko erabiltzen dira genetika, biokimika, immunologia, medikuntza, etab. alorretan. Oinarrizko ikerketetan aplikatzen ez ezik, geneen isolamenduan, klonazioan eta azido nukleikoen sekuentziaren analisian, gaixotasunen diagnostikorako edo edozein lekutan ere erabiltzen dira. non DNA edo RNA dagoen, eta laborategietan botatzeko eta kontsumitzeko gaiak dira.

Biologia molekularreko teknika gisa, polimerasaren kate erreakzioa (PCR) DNA zati zehatzak anplifikatzeko erabiltzen da. Organismo bizidun baten gorputzetik kanpo DNAren erreplikazio berezi bat dela pentsa daiteke. PCRren ezaugarririk garrantzitsuena DNA-kopuru txikiak izugarri handitzeko gaitasuna da. Beraz, paleontologia fosilizatuan, pertsonaia historiko baten aztarnak edo hiltzaile batek duela urte asko utzitako ilea, azala edo odola axola gabe, DNAren zati txiki bat isolatu daitekeen heinean, PCR anplifikatzeko erabil daiteke. DNA eta konparatu. Hor dago "arrastoen froga"ren indarra.

1983an sortu zuen lehen aldiz Mullisek eta 1985ean asmatu zuen polimerasaren kate-erreakzio gisa, PCR teknologiaren benetako sorrera suposatu zuena. 1976an, Qian Jiayun zientzialari txinatarrak, Taq DNA polimerasa egonkorra aurkitu zuenak, oinarrizko ekarpena egin zuen PCR teknologiaren garapenean. Ia 40 urte igaro dira PCR teknologia asmatu zenetik, eta PCR teknologia hirugarren belaunaldiraino garatu da. Azken ia 40 urteotan, PCR teknologiak ekarpen ezabaezina egin du bizitzaren zientzien garapenean.

Asmatu ondoren PCR teknologia, Mullisek honela deskribatu zuen: "ADN molekula bakar batekin, PCR-k 100 milioi antzeko molekula ekoiz ditzake arratsalde batean. Behar zen guztia hodi bat, erreaktibo sinple batzuk eta berotzeko gailu bat zen".

Hasierako PCR teknika komun bat erabili PCR anplifikadorea xede-genea anplifikatzeko, eta, ondoren, produktuak agarosa gel elektroforesiaren bidez aztertu ziren, kualitatiboki bakarrik egin daitekeena.

Posible da aztarna kopurua handitzea DNA nabarmen. Krimen-eszenetako fosiletan, ilean, azal-zatietan edo odoletan aztarna paleontologikoak detektatzeko, betiere DNAren zati txiki bat isolatu daitekeen bitartean, PCR erabiliz anplifikatu eta alderatu daiteke.

PCR DNA zati zehatz bat anplifikatzeko erabiltzen den biologia molekularreko teknika bat da, organismotik kanpo DNAren erreplikazio berezitzat har daitekeena.

a. Jatorrizko PCR teknikan erabiltzen diren azido nukleikoko koloratzaileek kalteak eta kutsadura eragingo dituzte laborategiko langileei eta ingurumenari.

b. PCR amaitu ondoren ireki eta probatu behar da, kutsadura eta emaitza faltsu positibo izateko joera duena.

c. Entseguak denbora asko hartzen du, arazotsu eta akatsetarako joera du.

d. Proba kualitatiboak soilik egin daitezke

PCRren bigarren belaunaldiari PCR kuantitatibo fluoreszentearen teknika deritzo.Denbora errealeko PCR), baita qPCR. Fluoreszentzia-PCR-k anplifikazio-produktuen metaketa kontrolatzen du erreakzio-sistemari zunda fluoreszenteak gehituz, hausnarketa-prozesua adieraz dezaketen eta seinale fluoreszenteak metatuz. Emaitzak fluoreszentzia kurben bidez epaitzen dira eta Cq balioen eta kurba estandarren laguntzaz kuantifikatu daitezke.

Gaixotasun infekziosoen patogenoak detektatzeko, gaixotasunen botiken erresistentzia geneen ikerketarako, sendagaien eraginkortasunaren ebaluaziorako, gaixotasun genetikoak diagnostikatzeko eta abar.

a. Kutsadura-arrisku txikia.

b. Eragiketa prozesua lehen baino sinpleagoa, ekonomikoagoa eta eraginkorragoa da.

c. ADN eta RNA gutxiago laginak gehitzea eskatzen du.

a. Fabrikatzaile ezberdinen erreaktiboen eta ekipoen Cq balioak ez dira konparagarriak.

b. Atzeko planoko balioen eraginez emaitzak erraz albora daitezke.

c. Zaila da kopia baxuko DNA detektatzea.

d. PCR sistema konbentzionalak askotan eragiten dute PCR inhibitzaileak erreakzio sisteman daudenean.

PCR teknologiaren hirugarren belaunaldiari Digital PCR, dPCR edo Dig-PCR deitzen zaio. Azido nukleikoak detektatu eta kuantifikatzen dituen PCR saio berri bat da. Xede molekulen zenbaketa zuzena erabiltzen du inolako kalibratzaile edo itxurarengan fidatu gabe, eta horri esker, kopia bakarrera detektatzeko xede-molekula kopuru absolutua zehaztea ahalbidetzen du.

Zelula normalen populazio handi batean mutazioa duten zelula kopuru txiki bat detektatzeko. Laginaren DNA dagozkion saiakuntza-hobietan diluituz, PCR anplifikazioaren ondoren, zunda fluoreszente espezifiko bat gehitzen zaio putzu bakoitzari produktuarekin hibridatzeko, eta, ondoren, laginean dauden mutante eta basati-mota alelo kopurua zuzenean zenbatzen da. Aplikazio nagusiak mutazioen analisia, ezabaketa alelikoa, DNA mistoaren minbizia detektatzea eta abar dira.

PCR digitalak PCR erreakzio tradizionala hamarnaka sistematan banatzen du. Sistema hauek modu independentean anplifikatu eta modu independentean detektatzen dira, zifra bakarreko txantiloien kopuru bat detektatu ahal izango dela bermatuz.

PCR digitalak zuzenean zenbatzen du erreakzio bateko txantiloien hasierako kopurua mikrosistemen fluoreszentzia zenbatuta. Mikrotanta batzuetan txantiloi bat baino gehiago badago ere, Poisson banaketaren bidez kalkula daiteke.

PCR digitalaren lehen urratsean erreakzio-sistemaren banaketan, txantiloia eta inhibitzailea sistema ezberdinetara esleitzen dira inhibitzaileen interferentziak murrizteko. qPCR-k ez bezala, dPCR-k amaierako fluoreszentzia detektatzen du, eta mikrosistema apur bat kaltetuta badago ere, ez du azken emaitzaren interpretazioan eragingo.

PCR digitalak erreakzioak hamarnaka mila sistema independentetan banatzen dituenez, txantiloi kopuruaren eskakizun nahiko handiak ditu. Mikrosistema kopurua gainditzen duen txantiloi kopuruak kuantifikazioa huts egitea ekarriko du, eta kopuru gutxirekin seinale baxua ekarriko du eta kuantifikazioaren zehaztasuna murriztuko du.

PCR digitalak sistema bakoitzean amaierako fluoreszentzia behatzen du. PCR produktua espezifikoa den ala ez, fluoreszentzia seinalea nahikoa indartsua den bitartean, emaitza positibo gisa ere interpretatzen da. Hori dela eta, dPCRren lehen espezifikotasuna oso zorrotza da.

PCR plakak Batez ere polipropilenoz (PP) eginda daude, eta horrek hobeto egokitzen dira PCR erreakzioetan tenperatura altuko eta baxuko ezarpenetan behin eta berriz, eta autoklabe eragiketekin erabil daitezke. Errendimendu handiko funtzionamendua lortzeko ilara-pistolekin eta PCR tresnekin, 96 putzuko PCR plaka 384 putzuko PCR plaka gehiago erabiltzen dira. Mota desberdinak daude gonadun plakak. Gonak egonkortasun ona ematen du pipeteatzeko erreakzio-sistemaren eraikuntzan eta erresistentzia mekaniko ona manipulazio mekaniko automatizatua egiterakoan. Gonaren diseinuaren arabera, PCR plaka PCR plaka ez-gona, PCR plaka erdi-gona, PCR plaka osoa eta profil erdi-gona azkar edo baxuko plakatan bana daiteke.

(96 PCR plaka / gonadun 96 putzu plaka / aplikatutako biosistemak 96 putzu plaka)

(384 PCR plaka / PCR plaka 384 / aplikatutako biosistemak 384 putzu PCR plaka)

Ez dago inguruko panelik gonarik gabeko PCR plaka. Plaka hau PCR tresna eta denbora errealeko PCR tresnen modulu gehienetara moldagarria da, baina ez da egokia automatizazio aplikazioetarako.

(denbora errealeko pcr plaka / rt pcr plaka / qpcr 96 putzu plaka / qpcr 384 putzu plaka )

The erdi-gona plaka, ere ezaguna erdi gona PCR plaka, ertz labur bat du plakaren ertzaren inguruan. Horrek euskarri egokia eskaintzen du pipetatzean eta erresistentzia mekanikoa makina maneiatzeko.

(96 putzu pcr / qpcr plaka / gona pcr plaka)

Gona osoa PCR plakak plakaren altuera estaltzen duen ertz-panel bat du. Plaka-formatu hau modulu irtenak dituzten PCR tresnetarako egokia da eta doikuntza segurua eta segurua ahalbidetzen du. Gona osoak erresistentzia mekanikoa ere hobetzen du, lan postu automatizatuetan erabiltzeko egokia da.

(96 putzuko plaka osoa / taqman array plakak / PCR plaka zuriak)

Denok dakigunez PCR oinarrizko metodo esperimentala dela biokimiko laborategietan. Emaitza esperimentalak, ordea, beti ez dira asegarriak, ziurrenik PCR plastikozko kontsumigarrien arrastoen kutsaduragatik edo inhibitzaileak sartzeak eragindako interferentzia esperimentalengatik. Arrazoi askok eragiten dute emaitzetan PCR esperimentuak:

a. Primerak - PCR espezifikotasunaren gakoa dira. PCR produktuen espezifikotasuna abiarazleen eta ADN txantiloiaren arteko osagarritasun mailan oinarritzen da.
b. Entzimak eta haien kontzentrazioa.
c. dNTPren kalitatea eta kontzentrazioa.
d. Txantiloi baten azido nukleikoa (helburuko genea).
e. Mg2+-ren kontzentrazioa.
f. Tenperatura eta denbora ezarpenak.
g. Ziklo-kopurua aldiz.
h. Ekipoak, kontsumigarriak, etab.

Horien artean, kontsumigarriak oso faktore garrantzitsuak dira eta erraz ahaztu egiten dira.

PCR/qPCR kontsumigarriak, oro har, polipropilenoz (PP) eginda daude, material biologikoki geldoa delako. Material honen gainazala ez da erraz itsasten biomolekulei eta erresistentzia kimiko eta tenperatura tolerantzia ona du. Material hauek erreaktibo edo laginekin zuzeneko kontaktuan egon ohi dira eta, beraz, kalitate handiko materialak eta prozesamendu ona behar dituzte ekoizpen eta prestaketa prozesuan.

zubi PCR hodiak PCR erreakzioen baldintzak betetzen dituzten bolumenetan eskuragarri daude. Hala ere, bolumen baxuko hodiak hobesten dira eskakizun esperimentalak betetzeko. Hau da, bolumen baxuko hodiek/plakek leku gutxiago dutelako gainean, eta horrek bero-transferentzia-tasa hobetzen du eta lurrunketa murrizten du. Gainera, laginak gehitzean, beharrezkoa da lagin gehiegi edo gutxi gehitzea saihestea. Gaindosiak eroankortasun termikoa, isuriak eta kutsadura gurutzatua murriztea ekar dezake. Lagin gutxiegiak laginaren lurrunketa galtzea eragin dezake.

* Hodi bakarra / hodi akoplatua: 0.5 ml, 0.2 ml, 0.15 ml

* PCR plaka: 0.1 ml pcr plaka / 0.2 ml pcr plaka / 24 putzu pcr plaka / 96 putzu qpcr / 384 putzu pcr / … …

PCR plakaren estalkia in flat-ek fluoreszentzia-seinalearen transmisio zehatza eskaintzen du q9PCRrako eta markatzaileak idazteko erraza da.

Estalki ganbilak PCR tresnaren estalki beroarekin kontaktuan jartzen du presioak eragindako erreakzio-hodiaren deformazioa murrizteko. Hala ere, fluoreszentzia seinalearen transmisioan eragingo du eta ezin da qPCR esperimentuetan erabili.

PCR erreakzio arruntetarako, PCR hodi argiak edo koloretakoak erabil daitezke. Koloretako PCR hodiak erabilgarriagoak dira laginak sailkatzeko eta kudeatzeko.

qPCR-k fluoreszentzia-seinalearen intentsitatea denbora errealeko detekzio kuantitatiboa eskatzen duenez, fluoreszentzia-seinalearen transmisio sentikorra eta zehatza oso beharrezkoa da. The PCR plaka zuriak Seinale fluoreszenteen isla maximizatu eta putzuen arteko seinaleen kutsadura gurutzatua murriztea, eta horrek denbora errealeko PCR kuantitatibo fluoreszentearen emaitzak optimiza ditzake.

Gurea interesatzen bazaizu PCR plaka edo zalantzaren bat baduzu, idatzi mezu elektroniko bat helbide honetara [posta elektroniko bidez babestua], ahalik eta azkarren erantzungo dizugu.