katalogoa: Ekipamendua-Elisa-Kit-ekoizpena
ELISA, du entzimekin lotutako immunosorbent-ensayoa, teknika immunoentzimatikoen klase erabili ohi da. Metodo nagusia antigeno edo antigorputz ezagun bat fase solidoko eramaile baten gainazalean xurgatzea da, ondoren entzimarekin etiketatutako (akoplatua) antigorputz edo antigenoa harekin inkubatzea, kolore garatzaile bat gehitu kolorea garatzeko, kolorearen arteko aldea zehaztu. neurtu beharreko analitoaren eta estandarraren kolorea entzima-markatzaile baten bidez, eta marraztu entzimaren jarduera-kurba neurtu nahi den analitoaren kontzentrazioa lortzeko.
ELISA bat egiteko zazpi pauso daude:
ELISA zuzena antigenoa immobilizatzea da ELISA plaka eta gero erabili entzimaz markatutako antigorputza antigenoa zuzenean detektatzeko.
Beste ELISA esperimentu mota batzuekin alderatuta, ELISA zuzeneko esperimentuek urrats gutxiago dituzte, detekzio azkarragoa eta ez dute bigarren mailako antigorputzak erabili beharrik, erreaktibitate gurutzatua saihesteko, neurketaren emaitzak ez dira akatsak izateko joera. Hala ere, ELISA zuzenaren antigenoa zehazki finkatuta ez dagoenez, xede-proteina eta laginaren beste ezpurutasun batzuk ELISA plakari lotuko dira, eta hondo esperimentala handiagoa izango da. Eta ELISA zuzenaren xede-proteina bakoitzak berariaz lotu daitekeen antigorputz primario bat prestatu behar du, esperimentua ez da hain malgua. Gainera, bigarren mailako antigorputzak erabiltzen ez direnez, seinalea ez da anplifikatzen, saiakuntzaren sentikortasuna murriztuz.
Zeharkako ELISA bi urratseko prozesu bat da, non antigeno bat ELISA plaka batera lotzen den, eta, ondoren, bi urratseko prozesu bat da, non detekzio antigorputz bat gehitzen den antigenoari zehazki lotzeko, eta entzimaz markatutako bigarren mailako antigorputz bat gehitzen da. detekzioa eta kolorearen garapena substratua erabiliz.
ELISA zuzenarekin alderatuta, zeharkako ELISAk entzimekin markatutako bigarren mailako antigorputzak erabiltzen ditu, sentikorragoak eta etiketatutako antigorputz gutxiago behar dituztenak, ekonomikoagoa eginez. Zeharkako ELISAk ere malgutasun handiagoa eskaintzen du, antigorputz primario desberdinak etiketatutako bigarren mailako antigorputz bakarrarekin erabil daitezkeelako. Zeharkako ELISA esperimentuen desabantailak erreaktibotasun gurutzatua izateko aukera (entzimarekin markatutako antigorputz sekundarioa antigenoarekin zuzen lotzea), hondoa areagotu dezakeena, eta bigarren mailako antigorputza inkubatzeko urrats gehigarria dira ELISA zuzenarekin alderatuta, luzatzen duena. ziklo esperimentala.
Batean ogitarteko ELISA, harrapatzeko antigorputza lehenik ELISA plakaren putzuetan inmobilizatuko da, eta gero lagina gehitzen da, eta detektatzeko antigorputza. Detektatzeko antigorputza entzimarekin markatuta badago, sandwich ELISA zuzena dei daiteke; detekzio-antigorputza ez badago etiketatuta, detekzio-antigorputzarekin lotzeko entzimaz markatutako antigorputz sekundario bat ere erabiltzea beharrezkoa da, eta zeharkako ELISA sandwich deitzen zaio horri.
Ogitarteko ELISAren sentikortasuna handia da, ELISA zuzena edo zeharkakoa baino 2-5 aldiz sentikorragoa da; aldi berean, sandwich ELISAk bi antigorputz espezifiko erabiltzen ditu antigenoari lotzeko eta espezifikotasun handia du. Gainera, ELISA sandwichak bide zuzen edo zeharkako bidez detektatu dezake, eta hori malguagoa da. Ogitarteko ELISAren desabantaila pareko antigorputzetarako eskakizun handia da. Kit estandarizaturik edo probatutako antigorputz parekaturik ez badago eskuragarri, parekatutako antigorputz pertsonalizatzea eta optimizatzea beharrezkoa da, garrantzitsua baita harrapatzeko eta detektatzeko antigorputzen arteko erreaktibotasun gurutzatua murriztea.
The lehiaketa ELISA fase solidoko garraiatzaile batean aurrez kapsulatutako antigeno bat da, espezifikotasuneko entzimarekin markatutako antigorputz batekin. Esperimentuan zehar, probatu beharreko antigenoa (edo antigorputza) gehitzen da. Proba antigenoa bada, probatu beharreko antigenoa fase solidoko garraiatzailean aurrez kapsulatutako antigenoarekin lehiatzen da entzimarekin markatutako antigorputza lotzeko; proba antigorputza bada, probatu nahi den antigorputza sisteman jatorrian dagoen entzimarekin markatutako antigorputzarekin lehiatzen da fase solidoko garraiatzailean kapsulatutako antigenoa lotzeko. Lehiakortasunean loturiko antigorputza garbiketa bidez garbitzen da eta, azkenik, substratua gehitzen da kolorea garatzeko. Garrantzitsua da kolorearen garapenaren emaitza detektatu beharreko antigenoaren (edo antigorputz) kantitatearen alderantziz proportzionala dela.
Lehiaketako ELISA goian deskribatutako hiru metodoak baino apur bat konplexuagoa da, baina aurreko hiru ELISA motak lehiaketako ELISA moduan aplikatzen dira. Bere abantaila nagusia da lagin ezpuruak detektatu ditzakeela eta datuen erreproduzigarritasun handia duela, baina sentsibilitate eta espezifikotasun orokor eskasaren arazoa du.
Kontrol negatiboetarako emaitza positiboak
a. Laginak, erreaktiboa kutsatuta dago edo laginak gehitzean funtzionamendu desegokiak kutsadura gurutzatua eragiten du ondoko putzuen artean disoluzioa isuriz - ordezkatu erreaktiboak eta ibili arretaz.
b. Entzimaren plaka ez da ondo garbitzen: bota antigorputz-soluzioa garbitu plaka garbitu aurretik, eta, ondoren, garbiketa-soluzioa plaka-putzu guztietan bota ezazu guztiz garbitu daitekeela ziurtatzeko.
c. Gehiegizko antigorputz kopuru batek lotura ez-espezifikoa dakar - erabili antigorputza argibideetan gomendatutako kantitatearen arabera eta diluitu antigorputza dagokion kontzentraziora.
Entzimaren plaka atzeko plano orokor altua
a. Antigorputzen lotura ez-espezifikoa - ziurtatu putzuak itxita daudela eta itxiera-soluzio egokia erabiltzen dela lotura ez-espezifikoa saihesteko.
b. Substratua lotzeko kontzentrazio altua - substratua behar bezala diluitu.
c. Erreakzio-denbora luzeegia da - amaitu erreakzioa amaierako soluzio batekin plakak xurgantzia irakurtzeko nahikoa kolore garatu bezain laster eta laburtu garapen-denbora behar bezala.
d. Substratu-soluzioaren kutsadura - Substratu-soluzio arruntak argia eta gardena izan behar du, horia edo beste kolore batzuk agertzen badira, kutsadura adierazten du eta substratu-soluzio berri batekin ordezkatu behar da.
e .Sustratoaren inkubazioa ez dago argitik babestuta - Substratuaren inkubazioa argiaren aurkako baldintzetan egin behar da.
Errepikatutako putzuen arteko errepikakortasun eskasa
a. ELISA lagin-kopurua ez da txukuna, eta picking-denbora luzea edo laburra da - saiatu picking-denbora lehen alditik hurbil mantentzen putzu bikoiztuak gehitzean.
b. Bolumen koherenterik gabekoa - laginak ondo nahastu behar dira diluitu aurretik eta pipeta-pistola bera erabili behar da.
c. Garbiketa-baldintza ez-koherenteak, operadoreak - Laginak errepikatzean, funtzionamendu-baldintzak eta langileak ahalik eta koherenteak izan behar dira azken aldiarekin.
d. Substratuaren inkubazioa ez dago argitik babestuta - Substratuaren inkubazioa argiaren aurkako baldintzetan egin behar da.
