Zelula-iragazkiak

Edukia
1. Zer dira zelula-iragazkiak?
    1.1 Zelula-iragazkien abantaila
    1.2 Zelula-iragazkiak aplikatzea
    1.3 Zelula-iragazkien zehaztapena
    1.4 Zelula-iragazkien zehaztapena
    1.5 Zelula-iragazkiak hautatzea
2. Zelula-iragazki mota
    2.1 Altzairu herdoilgaitzezko zelula-iragazkiak
    2.2 Nylon zelula-iragazkiak
3. Zelula-iragazkiak erabiltzea
    3.1 Zelula-iragazkiak garbitzea
4. Fluxu-zitometriarako zelula-iragazkia
5. Nola erosi zelula-iragazkiak?

Zelula-iragazkiak Oro har, laborategiko zelula-kulturan, ezpurutasunen filtrazioan, zelulen sakabanaketa, laginaren zatiketa eta abar erabiltzen dira. Zelula-iragazkia polipropilenozko marko batez egina izan ohi da, nylonezko pantaila konbinazio berezi batekin. Ohiko zehaztapenak dira zelula-iragazkia 40μm, zelula-iragazkia 70μm zelula-iragazkia 100μm pantaila irekidurak.

Zelulen biologiaren ikerketan, zelularen ezaugarri fisiologikoak, zelulen inbasioak, apoptosia, fagozitosia eta beste funtzio fisiologiko batzuetarako, ingurumen-faktoreek zelula-markatzaileen adierazpenean, droga-baheketa eta beste aplikazio batzuetan duten eragina, ezinbestekoa da homogeneizatu ezin hobea lortzea. zelula bakarreko konderriko fluidoa, ondorengo esperimentuak, hala nola flow-through cell sorting (FACS) bezalako esperimentuak erraz egin ahal izateko eta emaitza esperimental zehatzagoak lor daitezke. Zelula-iragazkiak zelula-esperimentuetan erabiltzen diren kontsumigarri mota ohikoenak dira. Esperimentu zelularretan erabiltzen den kontsumigarri mota ohikoena da eta esperimentu zelularretan ezpurutasunak iragazteko erabiltzen da.

a. Hiru tamaina eskuragarri daude zelula-lagin mota desberdinekin bat egiteko: 40 µm, 70 µm eta 100 µm.

b. Hiru kolore zehaztapen desberdinak bereizteko: urdina, zuria eta horia.

c. Sare-zuloen banaketa berdina, emaitza esperimental koherenteak eta fidagarriak emanez.

d. Goiko ertz hedatua pinza kirurgikoekin manipulazio aseptikoa ahalbidetzen du.

e. Moldeatutako polipropilenozko markoa kolorez kodetu daiteke erraz maneiatzeko eta bereizteko.

f. 50 ml JET zentrifuga-hodi konikoekin erabiltzeko.

g. Gamma-irradiazio esterilizazioa.

h. Ez DNasa/RNasarik, ez bero-iturririk, ez endotoxinarik.

Helburua zelula-iragazkiak Lehen mailako kulturan zehar zelula-masa haustea da, zelula bakarreko esekidura lortzeko.

a. Zelula bakarreko suspentsioa hezur-muinetik, pankreatik, timotik, amigdaletatik eta nodo linfatikoetatik isolatutako odol-zelulen iragazketaz lortzen da.

b. Lehen mailako zelulen hazkuntzarako eta immunizaziorako laginak prestatzea.

c. Serum inaktibatuetatik gliadina iragaztea.

d. Hazi primario izoztuak prestatzea.

-ren zuloak zelula-iragazkiak prozesatzeko zelula-iragazkia laser puntzonatzeko makina berezi batek zulatzen ditu. Lan-printzipioa da laserren gaineko laser izpia espazioan eta denboran oso kontzentratuta dagoela, eta horrek lekuaren diametroa mikra mailara murrizten du, horrela potentzia dentsitate handia lortuz, eta laser bidez ia edozein material zulatu dezake.

Zelula-iragazkiaren laser zulaketaren abantaila ez da errebarik, zigilatzea, hondakinik eta ebaki laua. Zelula iragazkien zuloaren laser zulatzean, zulaketaren tamaina koherentea da, erreba edo gainazal irregularra badago, hurrengo prozesua oso zaila izango da eta laser bidezko prozesamenduak geroago prozesatzea azkarrago eta kalitate hobeago egiten du.

Zelula-iragazkiaren bahearen sare kopurua × poroen tamaina = 15000 (aukeratu zelula-bahea dagokion sare-tamaina duen material esperimentalaren iragazki-poroen tamainaren arabera).

Zelula-iragazkiak Oro har, bi material nagusitan banatzen dira, bata plastikozko produktuak dira, esate baterako, nylona, ​​eta bestea altzairu herdoilgaitzezkoa.

Altzairu herdoilgaitzezko zelula-iragazkia altzairu herdoilgaitzez egina dago, gainazal leuna, itxura ederra eta ezaugarri iraunkorrak ditu. Altzairu herdoilgaitzezko zelula-iragazkiak 40 saretik 800 sarera arteko hainbat zehaztapen dituzte, orokorrean laborategiko zelula-kulturan, ezpurutasun-iragazketan, zelulen sakabanaketa, laginaren bereizketa eta abar erabiltzen direnak. Altzairu herdoilgaitzezko zelula-iragazkiak berrerabili daitezke, oro har, ultrasoinuen garbiketa eta gero esterilizazioa erabiliz. Zelula bahea bi motatan banatzen da altzairu herdoilgaitzezko zelula-iragazkia heldulekuarekin eta altzairu herdoilgaitzarekin zelula-iragazkia heldulekurik gabe, ikerketa zientifikoko esperimentuetarako funtzionatzeko erraza eta erosoa dena.

Fluxu arrunteko probako laginak 300-350 sarerekin erabil daitezke nylonezko zelula-iragazkiak, inbutu forman tolestuta eta pinza hemostatikoekin erabiltzen da.

a. Zelula-iragazkiak ezin dira garbitu ondoren azidotan busti, zuzenean esterilizatu daitezke lata paperean bilduta. Ez lehortu ehotzen erabiltzean. Ehun handiagoak iragazten dituzunean, buffera gehitu behar duzu artezketa bitartean.

b. 200 sare eta 300 sare arteko aldea zelula-iragazkiak zuloen tamaina da. Desberdintasun hori ez da oso handia fluxu mota egiterakoan, baina 300 sare erabiltzean, kontuz ibili gehiegi ez ehotzeko ehun konektibo gehiegi saihesteko.

c. Arratoiaren biriketako ehuna lor daiteke zelulen bahea artezteko zelulen nahasketa bat izan ondoren, biriketako parenkima-zelulak, estroma-zelulak, eritrozitoak eta leukozito, NK zelula eta makrofago kopuru txiki bat barne.

a. Bota eta botatzeko zelula-iragazkiak ez dira gomendatzen garbitu eta desinfektatzea, eta horrek iragazkiaren irregulartasuna eragin dezake eta hurrengo esperimentuaren emaitzetan eragina izan dezake.

b. Garbiketa alkalinoa diluitu hondar zelulak eta ehunak kentzeko.

c. Beratu eta garbitu deskalifikatzaileen soluzioarekin.

d. Kanpoko ura garbitzea, dH2O ur destilatua 3 aldiz, ddH2O ura berriro destilatua 3 aldiz, ontziak esterilizazioa.

Fluxu zitometria Suspentsioan dauden zelula bakarren edo partikula biologikoen analisi kuantitatibo eta sailkatzeko teknika bat da, abiadura handiko, zehaztasun handiko eta zehaztasunaren abantailak dituena, eta oso erabilia da zelulen zenbaketa, zelulen sailkapenean, fenotipo molekularren analisian, proteinen ingeniaritza eta bestelakoetan. ikerketa.

a. Kendu saguaren spleen 15 ml-ko zentrifuga-hodi batera (likidorik gabe) eta jarri hodia izotzean.

b. Gehitu 5 ml RBC lysis buffer spleea duen zentrifugatzaile-hodiaren 15 mlri.

c. Bota RBC lysis buffer eta spleen 10 cm-ko zelula-hazkuntzako plater batean.

d. Jarri spleen mutur bikoitzeko artezgailuaren alde zakar batean (RBC lysis buffer-arekin hezetuta), ondo zapaldu spleen mutur bikoitzeko labainan, eta birrindu bi irristagailu bikoitzeko artezgailuen artean, barea disoziatu arte. .

e. Transferitu esplenozitoak dituen RBC lisatua 15 ml-ko zentrifuga-hodi batera.

f. Gehitu 10 ml bitarteko zentrifugatzaileari eta alderantzikatu 2-3 aldiz.

g. Zentrifugatu 1300 rpm-tan 4 °C-tan 00:05:00etarako

h. Gaingaia bota eta hauspeakada berriro suspentsatu 3 ml-ko mediotan.

i. Iragazi 70 μM zelula-iragazkia 50 ml zentrifugatzaile-hodi baten bidez.

j. Diluitu zelulak 1:100ean eta zenbatu.

k. Diluitu zelula bakarreko esekidura 1 x 107 zelula/ml RPMI medioan (fluxuaren entseguetarako, ez da zelularik zenbatu eta zenbatu behar).

l. Jarri esplenozitoak izotzean 96 putzuko plakan sartu arte.

a. Prestatu Brefeldin A duen RPMI medio bat 10 μg/ml-ko kontzentraziora.

b. Vortex eta bira ezazu LPS stock soluzio guztiak, eta gero soinua egin bakoitza 00:10:00. Sonicazioaren ondoren, zurrunbiloa eta bira berriro.

c. Prestatu estimulu bakoitza (EC LPS, PA, YP, Lipido IVa) nahi den azken kontzentrazioa bikoiztu arte (2x) Brefeldin A duen medioarekin.

d. Pizgarri bakoitzeko 100 μl gehitzen dira 96 ml-ko 2.2 putzuko plaka baten putzu egokietan, estimulatu gabeko putzuak kontrol gisa barne.

e. Jarri 100 μl esplenozito egokiak diren hobietan (plakatu beste esplenozito multzo bat tindaketa-kontrol bakar gisa erabiltzeko).

f. Ondoren, inkubatu 37 °C-tan 04:00:00etan.

a. 04:00:00etatik aurrera, tratatu putzu plaka 20 mM EDTAko 20 μlrekin.

b. Nahastu eta inkubatu 37 °C-tan 00:10:00etan.

c. Berriro nahastu inkubazioaren ondoren, gero zentrifugatu 1300 rpm-n 00:05:00etan.

d. Aspiratu edo mugitu hedabideak.

e. Itxi putzu guztiak 10 μl FcBlock diluituarekin (1:100 FcBloc PBSA/az).

f. Inkubatu izotzetan 00:15:00etan.

g. Gehitu 100 μl PBSA/az eta zentrifugatu 1300 rpm-n 00:05:00etarako.

h. Aspiratu edo mugitu komunikabideak.

i. Berriro suspentsi/tindu 10 μl antigorputz nahasketarekin: CD11b PerCP-Cy5.5, CD11c PE-Cy7, CD19 APC-Cy7 eta CD3 APC (1:100Ab PBSA/az) estimulatutako esplenozito-laginarekin.

j. Gehitu 100 μl PBSA/az tindaketa bakarreko kontrolera, ondoren tindaketa bakarreko Ab hauetako 1 μl: CD8 FITC, CD8 PE, CD4 PerCP-Cy5.5, CD8 PE-Cy7, CD19 APC-Cy7 eta CD8 APC.

k. Inkubatu izotz gainean argitik babestuta (edo paperean bilduta) 00:20:00etan.

l. Gehitu 100 μl PBSA/az, gero zentrifugatu 1300 rpm-n 00:05:00etan.

m. Aspiratu edo mugitu euskarria.

n. Berriro suspentsi hobi guztietan 100 μl BDcytofix/cytoperm disoluzioarekin.

o. Inkubatu izotz gainean argitik babestuta 00:20:00.

or. Gehitu 100x BD Perm Wash 1 μl putzu guztietan.

q. Zentrifugatu 1300 rpm-an 00:05:00etan, eta gero aspiratu edo mugitu medioa.

r. Berriro eseki/garbitu behin 200 μl 1x BD Perm Wash-rekin, hainbat aldiz pipetatuz gora eta behera hobi guztietan.

s. Zentrifugatu 1300 rpm-an 00:05:00etan, eta gero aspiratu edo mugitu medioa.

t. Suspendatu/tindu esplenozitoen laginak 50 μl antigorputz nahasketarekin: TNF FITC eta IL-12/IL-23p40 PE estimulatutako esplenozitoei.

u. Inkubatu izotzetan 00:30:00etan argitik babestuta.

v. Gehitu 150 μl 1xBD Perm garbiketa hobi guztietara eta zentrifugatu 1300 rpm-n 00:05:00etarako.

w. Aspiratu edo mugitu hedabideak.

x. Berriro eseki/garbitu behin 200 μl 1x BD Perm Wash-rekin, hainbat aldiz pipetatuz gora eta behera hobi guztietan.

y. Zentrifugatu 1300 rpm-an 00:05:00etan, eta gero aspiratu edo mugitu medioa.

z. Suspendu berriro 200 μl-ko azken bolumen batean % 1eko paraformaldehido-disoluzioaren (% 10eko paraformaldehido diluitu 1xPBS-rekin).

aa. Gorde 4 °C-tan argitik urrun (edo paperean bildu) fluxu-zitometria-saiakuntzarako prest arte - transferitu laginak 96 putzuko plakatik buretara FACS baino lehen.

Gurea interesatzen bazaizu zelula-iragazkiak edo zalantzaren bat baduzu, idatzi mezu elektroniko bat helbide honetara [posta elektroniko bidez babestua], ahalik eta azkarren erantzungo dizugu.