Zelulak izozteko euskarriak
Zer da zelulak izozteko medio?
Zelulen kriokontserbazioa zelulak kontserbatzeko eta epe luzerako biltegiratzeko zelulak hazteko teknologiaren ohiko metodo bat da. Zelulak izozteko euskarriak, zelularentzat erabili behar den soluzio bat liofilizazioa, zelulen kontserbaziorako erabiltzen da eta funtsezko zeregina du zelulen erosketan, bidalketan, trukean eta entregatzean. Beraz, bereziki garrantzitsua da ona aukeratzea zelula-kultura izozteko medio.
Zelula-kultura izozteko medioa
Ikertzaileek askotan behar dute izoztu zelulak eta gorde itzazu ondorengo esperimentuetarako edo erabilera klinikorako. Oinarrizko prozesua nahiko erraza da: izoztu zelulak poliki-poliki, jarri kriokontserbazio-hodiak nitrogeno likidoan eta azkar desizoztu behar denean. Zelulak izozteko euskarriak zelulak onartzen ditu eta izotz-kristalak sortzea eragozten du. Hala ere, erabilera desberdinak emaitzak euskarriak izoztea oso ezberdina izan daiteke.
Ohiko zelulak izozteko medioek babes-agente bat gehitzen diote kultura-euskarriari, normalean %10eko dimetilsulfoxidoa (DMSO) eta %10-%90 behi-seruma. Zelulak konbentzionalean izoztean aurkitzen diren arazoak zelulen liofilizazio soluzioa honela laburbiltzen dira.
a. Prozedurazko hoztea (4 °C → -20 °C → -80 °C → nitrogeno likidoa). Urrats hau neketsua eta denbora asko eskatzen duena da.
b. Zelulen kutsadura arrisku handiagoa duen seruma duena (birusak, mikobakterioak, mikoplasmak, etab.).
c. Serumaren lote eta kalitatearen arteko desberdintasunek zelulak izozteko medioetan lote-desberdintasunak eragiten dituzte.
d. Nitrogeno likidoa izoztea beharrezkoa da izozte-behar handiak dituztenentzat.
e. Mikrobolumenak eta in situ (adibidez, putzu-plakak) ezin dira liofilizatu.
Serumik gabeko zelula liofilizazioko hiru produktu hauek serumik gabeko eta programatu gabeko hozte guztiak dira eta zuzenean -80 °C-ko hozkailuan jar daitezke epe luzerako izozteko eta gordetzeko.
A. Serumik gabeko zelulen liofilizazio-soluzioa
Produktuen funtzioa
a. Serumik eta animalia-jatorriko proteinerik gabe, birusen, mikobakterioen eta mikoplasmen kutsadura murrizteko.
b. Formula bereziak zelulen izozte-tasa eta berreskuratze-tasa eraginkortasunez hobetu ditzake.
c. Erabiltzeko prest, ez da beharrezkoa tokian bertan prestatzea.
d. Mota unibertsala, hainbat animalia eta gizaki zelula-lerro eta zelula primario izozteko eta gordetzeko egokia.
e. Konposizio argia, ez dago lote batetik bestera aldaketarik.
f. Ez da hozte programaturik eta ez da nitrogeno likidorik behar. Zuzenean -80 ℃-tan jar daiteke epe luzerako izozteko eta biltegiratzeko.
g. Mikro eta in situ izoztea (adibidez, hibridoma zelulen izoztea) posible da, denbora eta eraginkortasuna aurreztuz.
Izozte efektua
| Zelula-lerroa | Izozte denbora / (Hilabete) | Zelulen biziraupen-tasa (%) / (Izozteko tenperatura -80 ℃) |
|---|---|---|
| 293T | 12 | 95.58 |
| 4T1 | 12 | 96.25 |
| HUVEC | 12 | 88.14 |
| helao | 12 | 93.18 |
B. Serumik gabeko DMSO gutxiko zelulen kriokontserbazio-euskarria
Produktuen funtzioa
a. Segurtasun handia, serumik gabe eta animalia-jatorriko osagairik gabe, birusen, mikobakterioen eta mikoplasmen kutsadura-aukera txikia. Produktuaren kalitatearen koherentzia handiagoa lote batetik bestera.
b. DMSO baxua % 5eko DMSOarekin (v/v), eta horrek zelulen gaineko efektu toxiko potentzialak asko murrizten ditu.
c. Zelulen bideragarritasun handia, lote-desberdintasunik gabe.
d. Formulazio likido guztiz liofilizatua, zuzenean erabiltzeko prest, erosoa eta erraza. -80 ℃-ko hozkailuan gorde daiteke zuzenean izozteko eta biltegiratzeko, hozte programatuaren prozesu luzea igaro gabe (denbora, ahalegina eta dirua aurreztuz).
e. In situ izoztu daiteke, hibridoma zelulen azpiklonak bezala, eta horrek lan-karga izugarri murriztu eta kutsadura saihestu dezake.
Izozte efektua
| Zelula-lerroa | Izozte denbora / (Hilabete) | Konparazioa A Zelulen biziraupen-tasa (%) | Konparazioa B Zelulen biziraupen-tasa (%) | Zelulen biziraupen-tasa (%) |
|---|---|---|---|---|
| 3T3 | 1 | 86 | 89 | 97 |
| 293E | 1 | 85 | 86 | 93 |
| 293F | 1 | 85 | 85 | 92 |
C. Serumik gabeko DMSOrik gabeko zelulen kriokontserbazio-euskarria
Produktuen funtzioa
a. Segurtasun handia, serumik gabe eta animalia-jatorriko osagairik gabe, birusen, mikobakterioen eta mikoplasmen kutsadura-aukera txikia. Produktuaren kalitatearen koherentzia handiagoa lote batetik bestera.
b. DMSOrik gabe, ez du zeluletan eragin toxikorik.
c. Zelulen bideragarritasun handia, lote-desberdintasunik gabe.
d. Liofilizazio-soluzio osoaren formulazioa, zuzenean erabil daitekeena, erosoa eta erraza.
e. -80 ℃-ko hozkailuan zuzenean gorde daiteke izozteko, hozteko prozedura luzea egin gabe (denbora, ahalegina eta dirua aurreztuz). Ez da beharrezkoa programatutako hozte-tresna erabiltzea, eta ez da beharrezkoa -196 ℃-ko nitrogeno likidoan jartzea.
f. In situ izoztu daiteke, hibridoma zelulen azpiklonak bezala, eta horrek lan-karga izugarri murriztu eta kutsadura saihestu dezake.
Zelula izozteko euskarri unibertsalak serumik gabeko zelulak izozteko hiru euskarriekin alderatzea
| Zelula izozteko medio unibertsala | Serumik gabeko zelulen liofilizazio soluzioa | Serumik gabeko DMSO baxuko zelulen kriokontserbazio-medioa | Serumik gabeko DMSOrik gabeko zelulak kriokontserbatzeko medio | |
|---|---|---|---|---|
| Osagai nagusiak | Seruma, DMSO duena | Serumik gabe, DMSO %10arekin | Serumik gabe, DMSO %5arekin | Serumik eta DMSOrik gabe |
| Zitotoxikotasuna | High | High | Behe- | - |
| Segurtasuna | Behe- Animalia jatorriko birus, mikobakterio eta mikoplasmekin kutsatzeko arrisku handia | High Animalia jatorriko birus, lizun eta mikoplasmekin kutsatzeko arriskurik ez | High Animalia jatorriko birus, lizun eta mikoplasmekin kutsatzeko arriskurik ez | High Animalia jatorriko birus, lizun eta mikoplasmekin kutsatzeko arriskurik ez |
| Kriokontserbatutako zelula motak | Seruma duten zelulak izozteko egokia | Helburu orokorra Zelula kriokontserbazio mota guztietarako egokia | Helburu orokorra Zelula kriokontserbazio mota guztietarako egokia | Helburu orokorra Zelula kriokontserbazio mota guztietarako egokia |
| Serumik gabeko kultura-zelulen hazkuntza-egoera | Aldatzeko erraza, egoera esekitik harresiaren egoerara itzultzeko erraza | Mantendu esekiduraren kulturaren egoera | Mantendu esekiduraren kulturaren egoera | Mantendu esekiduraren kulturaren egoera |
| Loteen desberdintasunak | Alde handiak loteetan | Ez dago loteen desberdintasunik | Ez dago loteen desberdintasunik | Ez dago loteen desberdintasunik |
| Eragiketa metodoa | Urrats astunak, programatutako hoztea eta izoztea eskatzen dutenak | Erraza eta azkarra Urrats bakarreko izoztea -80 ℃ hozkailuan | Erraza eta azkarra Urrats bakarreko izoztea -80 ℃ hozkailuan | Erraza eta azkarra Urrats bakarreko izoztea -80 ℃ hozkailuan |
| Kontserbatzeko ekipoak | Eskakizun handia (nitrogeno likidoa) | Eskakizun baxua (-80 ℃ hozkailua) | Eskakizun baxua (-80 ℃ hozkailua) | Eskakizun baxua (-80 ℃ hozkailua) |
| Mikroizoztea | Zelula heriotza erraza eta biziraupen-tasa baxua | Zelulen biziraupen-tasa altua | Zelulen biziraupen-tasa altua | Zelulen biziraupen-tasa altua |
| In situ izoztea | Ez da bideragarria | Bideragarria eta erabiltzeko erraza | Bideragarria eta erabiltzeko erraza | Bideragarria eta erabiltzeko erraza |
Zelulak izozteko medioak erabiltzea
Berreskuratzeko zelula-kultura izozteko medioa
Zelula izozte eta berreskuratzeko oinarrizko printzipioa izozte motela eta desizozketa azkarra da. Esperimentuek frogatu dute horrek zelulen bideragarritasunaren kontserbazioa maximizatu dezakeela.
Gaur egun, zelulak izoztea glizerola edo dimetil sulfoxidoa erabiltzen du babes-agente gisa. Bi substantzia hauek zelula-mintzak urarekiko duen iragazkortasuna hobetu dezakete, eta izozte motelak zelula barruko ura zelulatik irtetea eragin dezake, zelula barneko izotz-kristalen eraketa murriztuz eta, horrela, izotza sortzeak eragindako zelulen kaltea murriztuz. kristalak. Zelulen suspertzea desizozte azkarraren bidez egin behar da, zelulaz kanpoko kristalak oso denbora laburrean urtzen direla bermatu eta desizozte geldoaren ondorioz zelulak kalteak saihestu ditzake, ura zeluletan sartzen uzten baitu zelulen barneko birkristalizazioa sortzeko.
Zelulen kriokontserbazioa tresna tekniko garrantzitsua da zelula-kulturarako, haziak sartzeko, haziak kontserbatzeko eta esperimentazio leunetarako. Garrantzitsua da zelula primarioak berehala izoztea zelula-kulturan eta leinu-ezarpenean. Hibridoma monoklonalaren antigorputz prestatzeko prozesuan, hibridoma zelulen izozte eta hazien kontserbazioa, klonazio bakoitzetik lortutako zelula subklonalak ezinbesteko eragiketa esperimentala izaten da. Zelula-lerro egonkor bat edo antigorputzak jariatzen dituen zelula-lerro egonkor bat ezarri gabe, zelula-hazkuntza prozesuak edozein unetan huts egin dezake zelulen kutsaduragatik, antigorputzak jariatzeko gaitasuna galtzeagatik edo mutazio genetikoa, etab. Jatorrizkoa izoztu gabe. zelulak, esperimentua galdu egingo da aipatutako istripuen ondorioz.
A. Zer da zelula izoztea?
Zelulak ondo hazten direnean eta eskaintzak eskaria gainditzen duenean, zelulak izoztuta daudela eta gero erabiltzeko gordeta daudela kontsidera daiteke. Tenperatura -70 ℃-tik beherakoa denean, zelulen barruko jarduera entzimatikoa gelditzen da eta jarduera metabolikoa gelditzen da, beraz, epe luzerako biltegiratzeko helburua lor daiteke. Zelulak izoztean, tenperatura jaisten den heinean, zelulen barruko eta kanpoaldeko ura kristalizatu egingo da, eta sortutako izotz kristalek zelula-mintzen eta organuluen suntsipena eragingo dute, horrela zelulen heriotza eragingo du, batez ere -20-0 ℃-ko fasean, izotz-kristalak orratz itxurakoak dira eta zelulen kalteak eragiteko errazak dira.
B. Nola murriztu daiteke zelula barneko izotz kristalen kalte hau?
Erabili zelulak izozteko medio. Komuna zelula-kultura izozteko medio glizerola edo dimetil sulfoxidoa da (DMSO), zelula-mintzean azkar sar daiteke zelula sartzeko, izozte-puntua jaistea, liofilizazio-prozesua atzeratzea eta zelula-mintzaren iragazkortasuna areagotzea, zelula barneko ioien kontzentrazioa areagotzea, eraketa murriztea. zelula barneko izotz kristalak, eta horrela zelulen babeserako helburua lortzen da.
C. Zelulen kriokontserbaziorako prestaketa
Liofilizazio-soluzioa prestatzea (normalean % 10 DMSO + % 90 FBS kultura-euskarriarekin). Edo zelulak izozteko medio: seruma: DMSO=7:2:1.
D. Kriokontserbazio eragiketa
Hautatu bideragarritasun ona eta %80 inguruko dentsitatea duten zelulak, zelulak hazkuntza-fasean daudenean eta liofilizaziorako egokienak direnean. Zelulen liofilizazioa oraindik horma-zelulen liofilizazioan eta esekidura-zelulen liofilizazioan banatzen da.
Zelulen egoera mikroskopiopean behatu. Zelulen dentsitatea altua bazen eta medioa horitzen bazen, likidoa 4 orduz aldatu behar zen liofilizazio eragiketa baino lehen. Zelulak guztiz hazi ondoren, hazkuntza-ontziko medioa pistola batekin arretaz xurgatu zen, eta ondoren PBS behin edo bitan garbitu zen, eta garbitutako PBSa xurgatzen saiatu, eta tripsina gehitu zen zelulak digeritzeko. Digestioan arreta jarri behar zaio tripsinaren ekintza-denboraren kontrolari, zelula bakoitza horman itsasten delako zelulen digestioa desberdina baita, eta digestio-denbora asko aldatuko da. Tripsinaren digestioa eragiketa delikatua da, ez bakarrik zelulak guztiz digeritzeko eta zelula bakarreko esekidura batean apurtzeko, txertaketa uniformea lortzeko, baita gehiegizko digestioak eragindako zelula-kalte larriak saihesteko ere. Bezero bakoitzak erabiltzen dituen tripsinaren jarduera, digestio-urratsak eta erreaktiboak desberdinak dira, beraz, digestio-denbora ezin da guztiz zehaztu, eta bezeroaren esperientziak gailenduko du. Digestio-urratserako, bezeroak zelularekin esperientzia gutxi badu eta tripsinaren ekintza-denbora zehaztasunez kontrolatu ezin badu, bezeroari honako eragiketa hau jarraitzea gomendatzen diogu: lehenik eta behin, gehitu zelula tripsina giro-tenperaturara berotu ondoren, jarri 37 ℃-tan. haztegi, eta gero zelula putz egin 30 segundoro, zelula putz egin badaiteke (zelula guztiz flotatzen egon arte ez bada digeritu), zelulen digestioa amaitu dela eta digestioa amaitu daitekeela esan nahi du. Zelulen digestioaren ondoren, zelulak ahalik eta leunki nahastu burbuila gehiegi ez sortzeko. 30 segundoko putz egiteak ez badu funtzionatzen, itxaron 30 segundo eta errepikatu eragiketa.
Digestioaren ondoren, gehitu 6-8 ML bitarteko oso digestioa amaitzeko, zelulak nahastu, bildu zelula esekidura zentrifugazio bidez 900-1000 rpm-n 3 minutuz, bota gainditzailea, gehitu prestatutako liofilizazio-euskarria, puztu astiro-astiro pipeta batekin. zelulak homogeneoak izateko, zatitu zelulak liofilizazio-hodietan, 1-1.5 ml hodi bakoitzeko, etiketatu liofilizazio-hodiak zelulen izenaz, liofilizazio-denbora eta eragilea eta jarri zelulak dituzten liofilizazio-hodiak horma lodietan. apar-kutxak. Zelulak horma lodiko apar-kutxa batean jarri ziren 4 ° C-ko hozkailuan 10-30 minutuz eta gero -80 ° C-ko hozkailuan jarri ziren gauean apar-kutxarekin batera.
Nola erosi zelulak izozteko euskarria?
Gurea interesatzen bazaizu Zelulak izozteko euskarriak edo zalantzaren bat baduzu, idatzi e-mail bat info@antiteck.com helbidera, ahalik eta azkarren erantzungo dizugu.