1886tik, Goldsteinek masa-espektrometro goiztiarretan erabili ohi zen ioi-iturria asmatu zuenetik, 1942ra arte, foku bakarreko lehen masa-espektrometroa merkaturatu zen arte. MALDI-TOF masa-espektrometria garapen teorikoko fasean zegoen funtsean. Geroago MALDI-TOF masa-espektrometria ionizazio-tekniketan eta teknika analitikoetan garatu eta hobetu izanak, bere aplikazio azkarra ekarri du alor askotan, hala nola geologian, espazio-ikerkuntzan, ingurumen-kimikan, kimika organikoa, eta farmazia.
MALDI-TOF masa-espektrometria Proteinen identifikaziorako eta analisirako laguntza-teknika garrantzitsu bat bihurtzen ari da lagin-ioien masa-karga erlazioa (m/z) zehaztuz konposizioa eta egitura-analisirako. Bi norabideko gel-elektroforesiaren bidez bereizitako proteina-puntuen identifikazioa, kopuru handian eta kopuru txikian, parametro horiekin bat datozen proteinak bilatuz egiten da, hainbat propietate-parametro erabiliz, hala nola masa molekular erlatiboa, puntu isoelektrikoa, sekuentzia, aminoazidoen konposizioa, peptido-masaren hatz-markak... Datu-basean aurkitzen ez bada, baliteke proteina berri bat aurkitzea eta sekuentzia-analisia egitea DNA zundak gehiago sintetizatzeko, adierazteko, isolatzeko eta identifikatzeko.
Geroago MALDI-TOF masa-espektrometria ionizazio eta teknika analitikoen garapenak eta hobekuntzak bere aplikazio azkarra ekarri zuen hainbat arlotan, hala nola geologian, espazio-ikerkuntzan, ingurumen-kimikan, kimika organikoan eta farmazian. Dena den, nahiz eta ionizazio bigunen masa-espektrometria teknikak, plasma desortzioa (PD) eta atomoen bonbardaketa azkarra (FAB), agertu ondoren, masa-espektrometria bidez aztertutako masa molekular erlatiboak milaka batzuen tartean zeuden. Benetako aldaketa 1980ko hamarkadaren erdialdean bi ionizazio-teknika berriren agerpenak irudikatu zuen: elektrospray ionizazioa (ESI) eta matrize bidezko laser desortzio-ionizazioa (MALDI), biak bi hauen sentsibilitate handia eta kalitate handiko detekzio-eremua dutenak. teknikek ahalbidetzen dute ehunka milarainoko masa molekular erlatiboko biomolekulak detektatzeko fmol (10-15) eta are amole (10-18) mailan, eta horrela masa-espektrometriaren eremu berri bat irekitzen da -masa-espektrometria biologikoa, eta Masa-espektrometria bizitzaren zientzien eremuan hedatu eta garatzea bultzatuz. Horrek bizitzaren zientzietan masa-espektrometriaren aplikazio eta garapen zabala ekarri du.
MALDI masa-espektrometriak osagai anitzeko analisi metodo azkar eta erraz konpondu dezake sentsibilitate, selektibitate eta zehaztasun handikoa, eta bere aplikazio-esparrua erradioimmunoensayoa eta detekzio kimikoa baino askoz ere handiagoa da. MALDI-TOF masa-espektrometria biologikoa laborategiko medikuntzan erabil daiteke batez ere osagaien sekuentzia aztertzeko, egituraren analisirako, pisu molekularra zehazteko eta izaki bizidunetako osagai bakoitzaren edukia zehazteko.
Azido nukleikoen MALDI-TOF molekularraren azterketa bizitzaren kimikaren, biologia molekularren eta medikuntzaren alorretan ikerketa-ildo dinamikoenetako bat bihurtu da. Masa-espektrometria biologiko modernoaren bidez, oligonukleotidoen masa molekularra ez ezik, haren sekuentziari buruzko informazioa ere lor dezakegu teknika garrantzitsuen bidez.
Bakterio-isolatu bakoitzaren MALDI-TOF bakterioak identifikatzeko erabil daiteke bakterio bakoitzaren eredu peptidiko edo hatz-marka berezian oinarrituta, eta Hsu-k masa-espektrometria tandem erabili du Salmonella J identifikatzeko. Bakterioen proteina-eduki handia dela eta, masa-espektrometria biologikoa egin daiteke. bakterio-genero, espezie eta anduiak identifikatzeko erabili ohi da; eta tandem masa-espektrometriak azukreen edo lipidoen gantz-azidoen konposizioa ere jo dezake; horrez gain, lagin biologikoak prozesatuz, tandem masa-espektrometriak bakterio eta espora patogenoak detektatu eta identifikatu ditzake bakterio bakarren mailan; osagai lipido espezifikoen azterketak laginaren bakterio patogenoen bideragarritasuna eta balizko infekzioa ezagutzeko aukera ematen du.
Masa-espektrometriaren aplikazioak farmazia-analisian honako hauek dira: droga sintetikoen osagaien analisia, sendagai naturalaren konposizioaren analisia, peptidoen eta proteinaren farmakoen sekuentzia aminoazidoen analisia (glukoproteinak barne), drogen metabolismoaren azterketak eta sendagaien konposizioaren azterketa. Laborategiko medikuntzan aplikazio gehiago sendagaien monitorizazioa (TDM) dira. Aurretik, drogak detektatzeko teknika immunokimikoak eta errendimendu handiko kromatografia likidoa erabiltzen ziren batez ere. Teknika immunokimikoa erraza eta erabiltzeko erraza den arren, neurtutako botiken barietatea nahiko txikia da. Errendimendu handiko kromatografia likidoaren teknikak droga mota gehiago zehazten dituen arren, karakterizazioaren fidagarritasuna eskasa da. Hala ere, kromatografia likidoa masa espektrometriarekin (LC.MS) konbinatuta drogak detektatzeko zehatza eta azkarra da eta ia sendagai guztietan erabil daiteke, hala nola minbiziaren aurkako sendagaietarako, immunosupresoreetarako, antibiotikoetarako eta sendagai kardiobaskularretarako, eta LC.MS teknologia izango dela espero da. drogak detektatzeko tresnarik indartsuena.
MALDI-TOF masa-espektrometriak honela funtzionatzen du:
Laserrak xede-plakako bakterioak kitzikatzen ditu, bakterio-proteinak huts-hodi batean hegan egitea ahalbidetzen duen substratu batekin. Detektagailuak hegaldiaren proteina-denboraren aldea detektatzen du profil bat sortzeko, datu-baseko informazioarekin alderatzen dena, bakterio-espezie posibleak ateratzeko.
The MALDI-TOF MS mainframe-ak bi zati ditu, ioi-iturria (MALDI) eta hegaldi-denbora (TOF) masa analizatzailea. MALDIren printzipioa laser-iturri bat erabiltzea da matrizearekin aztertu beharreko lagina irradiatzeko film kristalino bat osatzeko, matrizeak laserretik energia xurgatzen du biomolekulara transferitzeko eta ionizazio-prozesuak protoiak transferitzen ditu biomolekulatara edo haietatik. biomolekulak ionizatzeko. TOFren printzipioa da ioiak eremu elektrikoak azeleratzen dituela hegaldiaren hoditik hegan egiteko, eta m/z (hau da, ioien m/z ioien hegaldi denborarekin proportzionala da) eta seinalearen balioa lortzen dira. detektagailuaren iriste-denboraren eta ioien kopuruaren arabera, horrela dagokion masa-espektrometria gailurraren eredua osatuz. Makinan lortutako espektroak datu-basean ohikoa den erreferentziarekin aldera daitezke tentsiorik hurbilenak lortzeko, eta dagozkion identifikazio puntuazioak homologia distantziaren arabera ematen dira identifikazio azken emaitzak lortzeko.
Metodo honen printzipioa lagina molekula txikien matrize nahasketa batekin batera kristalizatzea da (azido zinamikoa, mostaza azidoa eta haien artikulatuak). UV laserrak (337 nm) kristala irradiatzen duenean, matrize molekulek energia xurgatzen dute lagina desorbitu eta ionizatzeko matrize molekulen bidez. Laginetik sortutako ioiek energia zinetiko bera hartzen dute eremu elektriko azeleratu baten eraginez eta hutsean eremu elektrikorik gabeko hegaldi-hodi batetik igarotzen dira, ioi arinenak azkarragoak dira eta lehenago iristen dira detektagailura, ioi astunenak geroago iristen dira detektagailura, eta hegaldi-denbora proportzionala da (m/z). MALDIk sortutako ioiak karga bakarreko ioiak dira gehienetan, eta masa-espektroetako gailur espektralek bat-bateko korrespondentzia dute laginaren osagai bakoitzaren masa-zenbakiarekin, beraz, MALD-MS da egokiena peptidoaren analisirako. proteina hidrolisiaren ondoren nahasketak. MALDI-ren masa-espektroak miaketa anitzen emaitzen emaitzekin pilatzen dira, tresna hau gaur egun dagoen masa-espektrometrorik sentikorrena bihurtuz, arrasto-laginak (fmol-amol) aztertzeko egokia.
Elektrospray ionizazio metodoak tentsio altua erabiltzen du masa espektrometroaren sarrerako muturrean zutabe kapilaretik ateratzen diren tantak kargatzeko, eta alderantzizko N2 gas korronte baten eraginez, tantek disolbatzailea lurruntzen dute, gainazala uzkurtzen da, gainazala. karga-dentsitatea handitzen da, eta tantak azpi-tanta kargatuetan lehertu egiten dira. Tantaren gainazaleko tentsioa hain da indartsua non analitoa ionizatzen baita eta masa analizatzailean sartzen da karga bakar edo anitzeko ioi gisa. Masa espektraleko gailurrek konposatu honen masa-karga-gailur sorta bat erakusten dute karga desberdinak dituztenak, software kalkuluen bidez karga bakarreko ioi molekularren gailurretan bihur daitezkeenak. Teknika honek fmolamol barrutian dauden laginak aztertzeko aukera ematen du.
Tandem masa-espektrometriak nahaste baten osagai baten azterketa selektiboa ahalbidetzen du, taldeak banandu gabe. Osagai guztien ioi molekularren gailurren ioiak lehen faseko masa-analizzadoreak lortzen ditu, eta analisi gehiagorako ioi nagusiak masa gainditzaile batek hautatzen ditu.
The zati ioiak (ioi alabak) sortzen dira, eta ioi alabak bigarren faseko masa-analisira elikatzen dira ioi nagusien zati-gailurrak lortzeko. Ioi gurasoen eta alabaren arteko zatiketa erlazioa aztertuz, peptidoen eta proteinen egiturazko informazioa lor daiteke.
Azken urteotan sartu den masa-espektrometro biologiko mota berria da. Bere masa-espektrometro nagusia elektrospray ionizazio-iturri bat da, masa-analizatzaile kuadripolo batekin, eta bigarren masa-espektrometroa hegaldi-denbora-masa-analizatzaile batek ordezkatzen du, zeinak tresnaren bereizmena eta sentikortasuna hobetzen ditu eta arrastoen laginen serie-analisia ahalbidetzen du.
Aleen aurretiko prestaketa
MALDI-TOF MS masa espektrometroak gaur egun ez daude kultura mistoetara egokituta, mikroorganismo zatiki puruak izan behar baitute. Kultura-euskarriaren, pellet solidoaren eta medio likidoaren aukeraketa teorikoki zertxobait desberdina da eta, oro har, ez du eraginik praktikan. Euskarri solido bat gomendatzen da ohiko identifikaziorako.
Euskarri solidoetarako, teorikoki selektiboak eta ez-selektiboak ez dute eragin handirik izango masa-espektrometriaren identifikazioan, baina hala ere gomendagarria da bakterioen hazkuntzarako medio ez-selektiboak aukeratzen saiatzea. MALDI-TOF MS identifikatzeko 105-107 kolonia (CFU) behar izaten dira bakterio kopurua osatzeko. Honela adierazi behar da hazkuntza-denbora: hazkuntza-epe labur batek, oro har, ez du identifikazio-emaitzetan eragiten, baina ezinezkoa delako zehaztea kolonia puruek, hala nola hazkuntza mistoak, identifikazio-emaitzen porrota eragin dezaketen ala ez. Esporak ekoizten dituzten mikroorganismoentzat, inkubazio denbora luzeegiak proteina-puntuaren seinalea eta lursailaren kalitatea gutxitzea ekarriko du, kasu horiek igaro ondoren identifikatu behar dira.
Helburuko pintura
Mikrobioen koloniak xedearen erdiko kokapenean aplikatzen dira eta uniformeki zabaltzen dira geruza mehe bat osatzeko.
Helburua aplikatzean, honako hauei erreparatu behar zaie: bakterio kopuru txikiegia aplikatzen da, analisi-seinale nahikoa ez izatea eta identifikazioaren porrota eragiten du; bakterio gehiegi aplikatzen da edo modu irregularrean aplikatzen da, eta horrek identifikazioaren porrota ere ekar dezake. Noiz estaldura xede-eremu osoa estaltzen saiatu behar da, xede-eremutik haratago erraza da kutsadura gurutzatua eragitea.
Koloni mukoideetarako: identifikazio-sistemak batez ere zelula barneko proteinak detektatzen dituenez, bakterio mukoideek mukopolisakaridoen lekak eratzearen ondorioz, xede gunean estalitako bakterioen kontzentrazioa diluitzen dute, eta horrek identifikazio-porrota ekar dezake. Bakterio mukoideen kasuan, identifikazioa hobetzeko metodo hauek erabil daitezke: ① Bakterio mukoideen koloniak ondo nahastu inokulazio-begizarekin, eta, ondoren, hartu lagin batzuk antzemateko; ② Garbitu poliki-poliki kolonien gainazaleko mocoa kotoi batekin, eta, ondoren, hartu beheko lagin batzuk antzemateko; ③ Hartu inokulazio-begizta duten kolonia zatituak EP hodietan 300 μl ur deionizatuarekin, guztiz sakabanatu eta garbitu, 16 000 ~ 19 000 × g, Zentrifugazio 2 minutuz, bota gaindikoa, eta eraman prezipitatua plaka antzera.
Lehorreko kolonietarako: kontuz ibili behar da osagai ertainak ez hautatzea, ahal den neurrian kolonia-hazkundearen hasierako fasean bilketa urriagoa da, azido formikoa erabiltzen saiatu daiteke. hodi proba xede-plaka estali aurretik ateratzeko.
Matrizearen fluidoa
Gehitu 2μLB likido tantaz tanta pipeta batekin, utzi modu naturalean lehortzen, gero 1.5μLA likido tantaz tanta gehitu xedearen erdian, lehortu eta neurtzeko itxaron.
Ontziko probak
Jarraitu MALDI-TOF tresnaren funtzionamendu-argibideak (lotearen aurreko kalibrazioa barne)
Datuak biltzea eta datu basearekin alderatzea identifikazio-emaitzak emateko
Identifikazio klinikoko emaitzen fidagarritasuna bermatzeko, MALDI-TOF MS-k lortutako identifikazio-emaitzak mikrobiologiako profesionalek berrikusi behar dituzte txostena eman aurretik, eta emaitzen zehaztasuna ebaluatu daiteke berrikuspen-prozesuan zehar laginaren iturria, tindaketa-emaitzak, morfologia konbinatuz. , kultura-baldintzak eta bestelako ezaugarriak, eta bigarren mailako identifikazioa edo esperimentu osagarri osagarriak egin behar dira emaitza susmagarriak lortzeko, eta emaitza ez-koherenteak gertatzen badira, berehala ikertu behar dira arrazoiak eta arrazoizko azalpenak eman. MALDI-TOF MS sistema ezberdinen emaitzen interpretazioa berdina ez denez, honako hau da merkatuan gehiago erabiltzen diren bi emaitzen berri ematearen eta interpretazioaren adibidea, beste MALDI-TOF MS sistema batzuentzat, jo. fabrikatzailearen argibideak.
