katalogoa: Ekipamendua-Elisa-Kit-ekoizpena
Printzipioa (ELISA) entzimekin loturiko immunosorbatzaileen saiakuntza) hau da:
Immunoensayoa antigorputz espezifiko bat antigeno edo erdi-antigeno bati neurtu beharreko antigorputza edo antigenoa aztertzeko eta zehazteko printzipioa erabiltzen duen metodo bat da.
ELISA-n, onarpen immunologikoa egiten da 96 putzuko plaka bat poliestirenoz egindako antigorputzez estaliz eta, ondoren, antigorputzak erabiliz neurtu beharreko antigenoa ezagutzeko (normalean gaixotasunen, birusen, bakterioen eta abarren biomarkatzaile proteina bat) eta antigenoa xurgatuz. 96 putzuko plakaren gainazalean neurtu beharreko disoluzio konplexutik. Ondoren, Horseradish Peroxidase (HRP), fluoreszenteak edo erradiomarkatutako antigorputzak erabiltzen dira errekonozimendu seinalea zuzenean edo zeharka ateratzeko. Azkenik, neurtu nahi den laginaren xede-antigenoaren kontzentrazioa kalkulatzen da seinalearen intentsitatea eta lagin estandarraren kontzentrazio-gradientea bezalako informazioa erabiliz.
Antigorputza 96 putzuko plaka batean kapsulatzen da. ELISAn, plaka poliestirenozkoa denez, antigorputzaren aminoazido-hondakinak dituen bentzenozko eraztun bat daukanez, π-π pilaketa-ekintzaren antzeko grabitate-indar batekin, efektu elektrostatiko eta hidrofobikoekin konbinatuta, antigorputza bere gainazalean xurgatu daiteke. . Xurgatu gabeko antigorputzak buffer batekin garbitzen dira eta gelatina edo BSA (Behien Serum Albumina) duen blokeo-disoluzio bat gehitzen da entzimaren plakaren antigorputz zatia zigilatzeko. Itxiera-soluzioa gehitzearen helburua da 96 putzuko plakan beste proteina batzuk adsorbatzea saihestea, efektu elektrostatiko edo hidrofobikoen ondorioz, seinale positibo faltsuak eraginez eta ondorengo esperimentuak oztopatzea.
Immunorekonozimendua 96 putzuko plaka antigorputzarekin estali ondoren, probatu beharreko lagina gehitzen da eta 37 °C-tan inkubatzen da denbora batez, normalean 1-2 orduz. Une honetan, entzimarekin markatutako plakan dagoen antigorputza antzemate espezifikorako probatu beharreko antigenoarekin lotzen da. Antigorputzaren kalitatea funtsezkoa da hemen, antigorputz on batek antigenoa berariaz eta eraginkortasunez lotuko baitu probatu beharreko laginaren beste osagai batzuek eragin gabe, hala nola biomolekulak, proteinak eta gatz ez-organikoek.
Garbitu ELISAn dagoen plaka. Garbitu lotu gabeko antigenoa, gehitu antigeno horri dagokion errekonozimenduaren antigorputza eta jarraitu 37 °C-tan inkubatzen 1-2 orduz, ondoren antigenoari atxikita ez dauden antigorputzak garbitu.
Entzimekin markatutako seinalearen irteera Entzimarekin markatutako bigarren mailako antigorputza Horseradish Peroxidase (HRP) etiketatua gehitzen da antigorputz estandarrari lotzeko. 30 minutuko inkubazioaren ondoren, konjokatu gabeko bigarren mailako antigorputza garbitzen da eta kolore-garatzaile bat gehitzen da kolorea garatzeko. Antigenoaren kontzentrazioa kolorearen garapenaren emaitzaren arabera zehazten da. Orokorrean uste da antigenoaren kontzentrazioa positiboki erlazionatuta dagoela kolorearen garapenaren ondoren lumineszentziaren intentsitatearekin.
Antigeno-lehiatzen duten antigorputzaren kasuan, adibidez, aurreko immunosandwiching-eragiketaren bigarren urratsean probatu beharreko antigenoa gehitu eta berehala, entzimarekin markatutako antigenoa gehitzen da, probatu beharreko antigenoarekin lehiatu dadin. entzimaz markatutako plakan dagoen antigorputza ezagutu. Probatu beharreko antigenoaren kontzentrazioa handiagoa denean, entzimarekin markatutako antigorputz gutxiago erantsi ahal izango dira entzimaren plakan dauden antigorputzetan, eta seinale gutxiago aterako da. Modu honetan, probatu beharreko laginaren kontzentrazioa alderantziz erlazionatuta dago entzimaren seinale kromogenikoarekin.
