katalogoa: Elisa Kit Fabrikaziorako ekipamendua
ELISA, entzimekin loturiko immunosorbent saiakera bezala ere ezaguna, gorputz-likidoetako hainbat helburu-proteinen edukia kuantitatiboki zehazteko metodo arrunta da.
Bere erreakzio kolorimetrikoak analisi kualitatiboa edo kuantitatiboa ahalbidetzen du, HRP entzimak katalizatutako TMB erabiliz, erreakzioak imina disoluzio urdina sortzen du, eta amaierako disoluzioa gehitzeak katioi urdina bifenilkinona horia bihurtzen du.
Urdin eta horiz gain, kolore ezohiko eta anitzak gertatzen dira ELISA esperimentuetan. Kolore bakoitzaren atzean esanahi berezi bat dago. Jarraian, ELISAren "itxuran" eta "irteeran" ezkutatzen diren kolore sekretuak aztertuko ditugu.
ren osagai batzuk ELISA kit kolore gorria/arrosa izango du babes-agente bereziak gehitzearen ondorioz, hala nola entzima-konjugatuen diluzio-serie jakin batzuk eta kontzentratuak. antigorputz biotinilatuak. Kolore honetako erreaktiboak normalean funtzionatzen dute eta argibideetako funtzionamendu-baldintzen arabera konfiantzaz erabili behar dira.
ELISA esperimentuetan, diluitzaileak kontserbatzaileak ditu eta normalean likido argia, gardena eta usainik gabekoa da. Diluitzailea lainotuta badago, usain egiten badu eta prezipitazioa sortzen badu, litekeena da bakterioekin kutsatuta egotea eta ez da gomendagarria gehiago erabiltzeko.
In entzimekin loturiko immunosorbent saiakuntza esperimentuak TMB substratua Argitik urrun gorde eta denbora gehiegi irekita utzi ez diren soluzioak airean dagoen HRP entzimak oxidatuko ditu eta urdin/urdin argia agertuko da. Egoera horietan zuzenean erabiltzeak emaitza positibo faltsuak ekarriko ditu. Hori dela eta, ez da gomendagarria urdin bihurtu den TMB irtenbidea erabiltzen jarraitzea.
Normal batean ELISA esperimentua, erreakzioa amaitzen da markatzailearen lehen lau putzuetan gradiente urdin argi bat agertzen denean substratu-disoluzioarekin inkubatu ondoren. Hala ere, inkubatutako HRP entzimaren konjugatuaren lan-disoluzioaren kontzentrazioa altuegia denean edo laginaren kontzentrazioa detekzio-eremua baino askoz handiagoa denean, kurba estandarraren 1-2 gradiente-putzu edo lagin-putzu altuenak berde iluna edo urdin iluna ager daitezke.
Lagin berde ilunak erreakzioa amaitu ondoren, 450 nm-tan irakurritako OD balioa benetakoa baino txikiagoa izan daiteke; urdin iluneko kalibrazio-kurba baliozko kalibrazio-kurba bat lortzeko eta laginaren kontzentrazioa zehatz-mehatz kalkulatzeko egokitu beharreko gradientearen OD baliotik gertuegi egongo da.
Gomendioak
1. Zorrotz kontrolatu inkubazio-tenperatura eta denbora urrats bakoitzean eta prestatu HRP entzimaren konjugatu lan-soluzioa argibideen arabera.
2. Kolorearen garapen-fasean, kontrolatu kolorearen garapen-denbora, lehenengo lau putzuetan gradiente urdin bereizgarri bat agertuz.
3. Kontzentrazio altuegia duten laginak kitaren detekzio-eremuaren barruan diluitu behar dira zehaztu aurretik.
ELISA esperimentuen emaitzen kolore horiaren arrazoi posibleak
ELISA lehiaketa metodoa sandwich metodoaren arabera funtzionatzen du: bi printzipioak desberdinak dira eta funtzionamendu-urratsak desberdinak dira, mesedez, arreta jarri bereizketari.
Garbiketa desegokia: astindu plaka hondakinen ontzitik gertuegi, eta ondorioz, atzeko zipriztina likidoa sortuko da; astindu plaka lehortu gabe, likido-hondakinak edo beste putzu batzuetara isurtzea eraginez; Putzu bakoitzari garbiketa-soluzio nahikoa injektatzen ez denean garbitzea edo garbiketa kopurua nahikoa ez denean; gainezka-kutsadura likido gehiegi; murgiltze denbora laburregia da.
Kromogenoaren biltegiratze desegokia edo argi-babesik gabeko inkubazioa, eta ondorioz kolore ez-espezifikoa garatzen da.
Inkubazio-tenperatura altuegia da, edo inkubazio-denbora luzeegia da.
Kitaren osagai desberdinak nahastea edo ordezkatzea, matrize-efektua edo adsortzio ez-espezifikoa eraginez, emaitza positibo faltsuak lortuz.
Irakurketak kalkulatu ondoren, kurba estandarraren doikuntza ona zela aurkitu zen, baina laginaren OD-ak kurba estandarraren OD maximoa gainditu zuen, lagina oraindik diluitu behar zela adieraziz.
Amaierako disoluzioa gehitu ondoren, ELISA plakaren putzuetako likidoa beltz bihurtzen da edo prezipitazio beltza sortzen da.
Arazo posibleak
HRP entzimaren kontzentrazioa altuegia da: HRP entzimaren lan-soluzioa prestatzean, ziurtatu kalkulua eta prestaketa bolumena zehatza dela, eta garbitu plaka argibideetako garbiketa-bolumenaren, denboraren eta aldiz-kopuruaren arabera.
Laginaren adierazlearen kontzentrazioa altuegia da eta lagina oraindik diluitu behar da.
Amaiera-disoluzioan azido sulfurikoaren kontzentrazioa altuegia da edo hondatuta dago: amaierako disoluzioa 1M H2SO4 da, azido sulfuriko kontzentrazio handiegia nahasteak ikatze-erreakzioa ekar dezake.
