Helburua ELISA proba esperimenturako oinarri esperimental zehatza eskaintzea da, eta datu esperimentalen fidagarritasuna bermatzeko, prozesu esperimentalean kalitate-kontrol integrala bete behar da, eta kalitate-kontroleko prozesu osoa, aleen bilketan plana osatu behar du aurretik. .
katalogoa: Elisa Kit Fabrikaziorako ekipamendua
1. Entzimarekin loturiko immunosorbent saiakuntza bakoitzeko bildutako laginaren bolumena = 100ulx saio mota, hobi anitz egin behar badira, bildutako laginaren bolumena = 100ulx saio mota x 2.
2. Du gero ELISA lagina aste batean bildu eta probatzen da, 2-8 °C-tan gorde daiteke. Proba garaiz egiten ez bada, mesedez zatitu lagina eta izoztu -20 °C edo -80 °C-tan izoztu eta desizoztea errepikatu ez dadin.
3. ELISA kitaren detekzio-tartea ez da laginaren analitoaren kontzentrazio-tartearen berdina. Dagokion literaturaren bidez ereduan analitoaren kontzentrazioa estimatzea gomendatzen da eta esperimentuaren aurretik aurre-esperimentazioaren bidez hautaketa zehaztea gomendatzen da.
4. ELISA serum-aleak kontu handiz bildu behar dira hemolisia saihesteko, eritrozitoen lisiak peroxidasa aktibitatea duten substantziak askatzen baititu, eta hemolisatutako ilustrazioek kolorearen garapen ez-espezifikoa areagotu dezaketelako.
5. Gernu-probaren zehaztasuna ziurtatzeko, ELISA bilketa erabiltzean, gernu-laginak eta kontserbazioa behar bezala bildu behar dira, gernu-ontziak garbi eta lehorra izan behar dira, eta hobe da botatzeko ontziak erabiltzea, erabilerak eragindako kutsadura saihesteko. drogak eta gutxiago garbitu, gernu-laginak freskoak izan behar dira, atxiki ondoren, berehala probatu edo gorde behar dira.
6. Aleak fresko probatu behar dira bakterioen kutsadura badago, bakterioak HRP endogenoa izan dezake, eta horrek erreakzio positibo faltsu bat ere sortuko du. Hozkailuan denbora gehiegi gordetzen bada, eta bertan polimerizazioa gerta daiteke, Lakeview hondoan ELISA metodo zeharkakoa sakontzen da.
7. ELISA laginak prozesatzeko esperimentuetan, laginaren izozte eta desizozte errepikatuek proteina-potentzia murriztuko dute, beraz, lagina proba anitzetarako probatzeko, zati kopuru txiki bat izoztea komeni da.
Lagin likidoak: seruma, plasma, gernua, zelula gainditzailea, likido zerebroespinala, etab.
Zelula haziak
Ehun-aleak
Oro har, 5 eguneko epean neurtutako ELISA serum laginak 4 °C-tan jar daitezke, gero hozkailuan denbora gehiegi gordetako aleak serum IgG polimerizatzea ekarriko du, zeharkako metodoaren atzeko erreaktiboa sakondu da, bat baino gehiago. astean -20 °C biltegiratzeko beharra zehazteko, serum izoztua disolbatuta, tokiko proteina-kontzentrazioa, modu irregularrean banatuta, guztiz nahastu behar da eta aire-burbuilak sortzea saihestu behar da.
Serum-ale lainotsuak edo prezipitatuak zentrifugatu edo iragazi behar dira lehenik eta ondoren argitu probatu aurretik.
Antigorputzak neurtzeko ELISA seroen aleak hainbat proba egiteko gorde behar dira, izotzetan kantitate txikietan.
ELSA seroen kontserbazioa funtzionamendu aseptikoari erreparatuta soilik bildu behar da, eta kontserbatzaile egokiak ere gehitu daitezke. Fibrinaren elementuen interferentziaren ondorioz antikoagulazio osatugabeak eragindako positibo faltsuko aleek antikoagulatzailerik ez erabiltzea gomendatzen da, batez ere heparina antikoagulatzailea.
Seruma: ELISA giro-tenperaturako odol koagulazio pribatua 10-20 minutuz, zentrifugazioa 20 minutuz (2000-3000 rpm). Gaingatzailea kontu handiz bildu eta berriro zentrifugatu behar da gordetzean prezipitazioa gertatzen bada.
Plasma: EDTA edo sodio zitratoa antikoagulatzaile gisa hautatu behar da entzimekin loturiko immunosorbenteen saiakuntzako laginen eskakizunen arabera, 10-20 minutuz nahastu, 20 minutuz zentrifugatu (2000-3000 rpm), eta gainnatzailea arretaz bildu eta berriro zentrifugatu, prezipitazioa sortzen bada
Gernua: hodi antzuetan bildu, eta 20 minutu inguru zentrifugatu (2000-3000 rpm), gainnatzailea kontu handiz bildu, eta kontserbazioan prezipitazioa sortzen bada berriro zentrifugatu behar da. Likido torakoabdominalak eta likido zerebroespinalak praktikari egiten diote erreferentzia.
Zelula-hazkuntza gainditzailea: ELISA jariatze-osagaiak detektatzean, bildu hodi antzuetan, Zentrifugazio 20 bat minutuz (2000-3000 rpm) eta kontu handiz bildu gainditzailea, eta zelula barneko osagaiak hautematen, zelulen esekidura PBSrekin diluitu (PH 7.2-7.4), eta zelula-kontzentrazioa milioi/ml ingurura iristen da, behin eta berriz izozte- desizoztea zelulak suntsitzeko eta zelula barneko osagaiak askatzeko.
Ehun aleak: ELISA aleak moztu ondoren, pisatu, gehitu PBS kopuru jakin bat, PH 7.4, azkar izoztu nitrogeno likidoarekin eta gorde erreserbatan. Aleak urtu ondoren, mantendu 2-8 °C-ko tenperatura edozein unetan, gehitu PBS kopuru jakin bat (PH 7.4), homogeneizatu aleak guztiz eskuz edo homogeneizatzailearekin, zentrifugatu 20 minutu inguru (2000-3000 rpm). ), bildu gaindikoa arretaz. Gaingatzailea kontu handiz bildu zen, zati bat probak egiteko eta gainerakoa izoztu eta alde batera utzi.
ELISA aleak bildu ondoren ahalik eta azkarren atera behar dira, eta dagokion literaturaren arabera atera behar da erauzketa, eta proba atera ondoren ahalik eta azkarren egin behar da.
ELISA saiakuntza-metodoak zuzeneko, zeharkako, lehian oinarritutako antigorputz bikoitzeko ogitarteko metodoak dira, eta horietatik zuzeneko metodoa eta lehiaketa metodoa gutxiago erabiltzen dira, antigorputz bikoitzeko ogitarteko metodoa izan beharko litzateke, sentikortasun geneen espezifikotasunean abantaila nabariak dituena.
Antigenoa ELISA klasean immobilizatzen da, eta, ondoren, antigenoa zuzenean detektatzen da entzimarekin markatutako antigorputzarekin.
Beste batzuekin alderatuta ELISA motak esperimentuak, ELISA zuzena esperimentuek urrats gutxiago dituzte, detekzio azkarra, bigarren mailako antigorputzak erabili beharrik ez, erreaktibotasun gurutzatua saihesten dute eta proben emaitzek ez dute akatsetarako joera.
Hala ere, ELISA zuzenaren antigenoa berariaz finkatuta ez dagoenez, xede-proteina eta lagineko beste ezpurutasun-proteina ELISA bertsiora lotuko dira, atzealde esperimentala handiagoa izango da eta ELISA zuzenean xede-proteina bakoitzak antigorputz primario bat prestatu behar du. berariaz lotu daitekeena, esperimentua ez da hain malgua. Gainera, bigarren mailako antigorputzak erabiltzen ez direnez, seinalea ez da anplifikatzen, saiakuntzaren sentikortasuna murriztuz.
Antigenoa ELISA klasean immobilizatzen da, eta, ondoren, antigenoa zuzenean detektatzen da entzimarekin markatutako antigorputzarekin.
Beste mota batzuekin alderatuta ELISA esperimentuak, ELISA zuzeneko esperimentuek urrats gutxiago dituzte, detekzio azkarra, ez dute bigarren mailako antigorputzak erabili beharrik, erreaktibotasun gurutzatua saihesten dute eta proben emaitzek ez dute errorerako joerarik.
Hala ere, ELISA zuzenaren antigenoa berariaz finkatuta ez dagoenez, xede-proteina eta lagineko beste ezpurutasun-proteina ELISA bertsiora lotuko dira, atzealde esperimentala handiagoa izango da eta ELISA zuzenean xede-proteina bakoitzak antigorputz primario bat prestatu behar du. berariaz lotu daitekeena, esperimentua ez da hain malgua. Gainera, bigarren mailako antigorputzak erabiltzen ez direnez, seinalea ez da anplifikatzen, saiakuntzaren sentikortasuna murriztuz.
Proba egiten ari den antigenoa bi antigorputzen artean kapsulatzen da, horietako batek antigenoa garraiatzaile batean inmobilizatu egiten du, hau da, harrapatzeko antigorputza, eta bestea detekzio antigorputza da, zeina entzimarekin markatu daitekeen antigeno-kantitatea zuzenean zehazteko, edo etiketatu gabe eta, ondoren, entzimarekin markatutako bigarren mailako antigorputzak neurtu behar dira, arretaz hautatu behar direnak, erreakzio gurutzatua duten zamak antigenoa lotzeko gune berdinarekin lehiatzen ez daitezen.
Antigenoa antigenoa bada, antigenoa lehiatuko da entzimaz markatutako antigorputz entzimaz markatutako antigorputza fase solidoko garraiatzaileari lotzeko. Detektatu beharreko substantzia antigorputza bada, detektatu nahi den antigorputza sistemako entzimaz markatutako antigorputzarekin lehiatuko da berriro solidotutako eramailean bildutako antigenoarekin lotzeko, lehiakortasunean loturiko entzimarekin etiketatutako antigorputza garbituz garbituko da. , eta azkenik substratua gehitu kolorea garatzeko.
Lehiaketa ELISA apur bat konplikatuagoa da goiko hiru metodoekin alderatuta, baina goiko hiru ELISA motak egokiak dira lehiaketa ELISA formarako, bere puntu nagusia lagin ezpuruak eta datuen erreproduzigarritasun handia detektatzea da, baina pobreen arazoa dago. sentikortasun eta espezifikotasun orokorra.
| kapsulatzea | Antigenoak edo antigorputzak fisikoki xurga daitezke fase solidoko eramailearen gainazalean, proteina eta poliestirenoaren gainazaleko adsortzioaren arteko zati hidrofoboak, adsorbitu ondoren, erreakzio antigenikoa eta beste jarduera immunologikoa mantendu ditzakeelako. |
| Etiketatua | Antigenoak edo antigorputzak kobalenteki lotu daitezke entzimekin, beren jarduera immunea eta entzimaren ezaugarri katalitikoak oraindik mantentzen dituzten entzima konjokatuak sortzeko. |
| Koloreen garapena | Entzima konjugatua fase solidoko garraiatzailean kapsulatutako antigeno edo antigorputzarekin lotu ondoren, fase solidoko garraiatzailean ere inmobilizatu egiten da, eta kolorearen garapen erreakzioa entzima-substratua gehitu ondoren gerta daiteke eta antigenoaren eduki erlatiboa edo. antigorputza erreakzioaren kolore tonuaren arabera kalkula daiteke. |
Espezifikotasuna: ELISA kitaren espezifikotasuna kitaren funtsezko osagaiarekin lotuta dago, antigorputz bikotearekin, antigorputz bikoteetako bat antigorputz anitz bada, bestea antigorputz monoklonal bat izan behar da, antigorputz monoklonal bikoitza erabiltzea gomendatzen da.
Sentikortasuna: Sentikortasunak kitak detektatu beharreko substantzia kopuru minimoa detektatzeko duen gaitasuna islatzen du, erabiltzaileak kit egokia aukeratu dezake bere laginetan detektatu beharreko adierazle kopuruaren arabera, detektatu beharreko adierazle kopurua bada. oso baxua, kit orokorrak ezin ditu baldintzak bete, ELISA kit oso sentikorra aukeratu dezakezu.
Errepikagarritasuna: esperimentu zientifikoek errepikakortasuna eskatzen dute, orokorra ELISA kitak, eta plakaren barneko periodo bat eta plaken arteko aldakuntza-koefizientea % 15ean kontrolatu behar dira.
Soiltasuna: zenbat eta denbora esperimentala laburragoa izan eta zenbat eta erosoagoa izan funtzionamendua, orduan eta litekeena da kit-a erabiltzaileak ongi etorria izatea, kalitate handiko datuak bermatzeko baldintzapean.
| Galdera | Arazo posibleak | Irtenbidea |
|---|---|---|
| Hondo altua edo kontrol negatiboa altua baino ez da Antigorputzen lotura ez-espezifikoa Entzima konjugatua gehiegi kontzentratuta dago Inkubazio-tenperatura altuegia Substratua berrerabili aurretik esposizioa Plaka irakurri baino lehen egonaldi denbora luzeegia | Kontrol negatiboko putzuak kontrol positiboko laginekin kutsatzen dira Blokeatzeko irtenbidea ez da egokia, ordezkatu blokeatzeko irtenbidea Mesedez, egiaztatu argibideen arabera entzima konjokatua diluitzen den Egiaztatu inkubagailuaren tenperatura zuzena eta egonkorra den Irakurketak amaierako soluzioa gehitu eta 3 minutuko epean egin behar dira leku ilun batean, argitik babestuta. | Ez isuri garbiketa-soluzioa putzuetatik kanpo garbitzean |
| Kurba estandarraren kurba estandarra ona da, baina laginak ez du detekzio seinalerik Lagineko beste substantziek detekzioa eragiten dute/iluntzen dute Balore baxu faltsuak HOOK efektuaren ondorioz laginaren detektagailuen kontzentrazio handien ondorioz | Laginaren detekzio maila ez edo oso baxua Beste substantzien interferentziak murrizteko diluzio egokia, edo serieko diluzioa, detektatzeko berreskurapena Diluitu lagina multiplo egokietan probaren kontzentrazioa kitaren detekzio-eremuan mantentzeko | Konfiguratu barne erreferentzia eta berriro esperimentatu |
| Errepikagarritasun eskasa Erreaktiboa ez da nahastuta Ezpurutasunak edo hauspeakinak laginean pipeta puntaz moztuta | Aire burbuilak putzuetan Ziurtatu erreaktiboen nahasketa egokia Erabili aurretik; zentrifugatzailea Kontuz ibili likidoa gehitzean | Erabili orratz-punta aire-burbuilak hautatzeko |
