Sitomèt koule
Ki sa ki sitomèt koule?
Sitomèt koule se yon aparèy pou analiz otomatik ak klasman selil yo. Li ka rapidman mezire, estoke ak montre yon seri de paramèt enpòtan byofizik AK byochimik nan selil dispèse sispann nan likid, epi li ka klasifye sous-ansanm selil espesifye yo dapre seri paramèt pre-seleksyon an. Pifò sitomèt koule yo se enstriman rezolisyon zewo, ki ka sèlman mezire kantite total asid nikleyik, total pwoteyin, ak lòt endikatè nan yon selil, men yo pa ka idantifye ak detekte kantite asid nikleyik oswa pwoteyin nan yon pati patikilye. Nan lòt mo, li gen zewo rezolisyon detay.
Prensip k ap travay nan sitomèt koule
Sitometri koule FACS
A. Prensip mezi paramèt
Mezi milti-paramèt ka fèt an menm tan pa sikometri koule, ak enfòmasyon an sitou soti nan siyal fliyoresan espesifik ak siyal ki pa fliyoresan gaye. Se mezi a te pote soti nan zòn nan mezi, sa yo rele zòn nan mezi se pwen an entèseksyon vètikal nan gwo bout bwa a lazè ak gwo bout bwa a koule likid ejecting bouch la. Lè yon sèl selil nan sant koule likid la pase nan zòn mezi a, lazè a iradye li epi gaye limyè nan tout espas la ak yon Ang solid 2π. Longèdonn limyè a gaye se menm ak longèdonn limyè ensidan an. Entansite ak distribisyon espasyal limyè gaye yo gen rapò ak gwosè, mòfoloji, manbràn plasma ak estrikti entèn selil la paske paramèt byolojik sa yo gen rapò ak pwopriyete optik selil la, tankou refleksyon ak refraksyon limyè. Selil ki pa te soufri okenn domaj gen karakteristik limyè gaye, kidonk diferan siyal limyè gaye yo ka itilize pou analize ak sòt selil vivan san yo pa tach. Siyal limyè a gaye nan selil fiks ak tache se sètènman diferan de sa yo ki nan selil k ap viv akòz pwopriyete yo chanje optik. Limyè a gaye pa sèlman ki gen rapò ak paramèt selil la kòm sant la gaye, men tou, ak faktè abyotik tankou Ang la gaye ak Ang solid la nan kote limyè a gaye kolekte.
In sikometri koule mezi, de kalite limyè gaye yo souvan itilize: a. Angaj Avant (0 Angle) gaye (FSC); b. Side scattering (SSC), ke yo rele tou 90 Angle gaye. Ang ki refere isit la refere a Ang ki fòme apeprè ant direksyon gwo bout bwa lazè a ak direksyon axial tib fotomultiplikatè ki kolekte siyal limyè ki gaye. Anjeneral pale, entansite a nan pi devan Ang limyè gaye ki gen rapò ak gwosè a nan selil yo ak ogmante ak ogmantasyon nan zòn kwa-seksyonèl selil pou popilasyon an menm selil. Eksperyans yo sou selil vivan esferik yo montre ke li se fondamantalman lineyè ak gwosè a nan zòn nan kwa-seksyonèl nan seri a nan yon ti Ang solid. Fòm konplèks la ak oryantasyon selil la ka trè diferan, espesyalman bezwen peye atansyon. Se mezi limyè ki gaye bò kote yo itilize sitou pou jwenn enfòmasyon sou pwopriyete granulaire nan estrikti amann entèn selil la. Malgre ke limyè ki gaye bò a gen rapò tou ak gwosè ak fòm selil la, li pi sansib a endèks refraktif manbràn selilè a, sitoplasm, ak manbràn nikleyè, epi li ka bay tou yon repons sansib a patikil ki pi gwo nan la. sitoplasm.
An pratik, enstriman an dwe premye mezire siyal difizyon limyè a. Lè yo itilize li an konbinezon ak sond fliyoresan, analiz difizyon limyè a ka distenge selil ki gen koulè ak selil ki pa gen koulè nan yon echantiyon. Itilizasyon ki pi efikas pou mezi difizyon limyè a se idantifye sèten sougwoup nan popilasyon etewojèn. Siyal fliyoresans lan gen ladan sitou de pati: a. Fliyoresans espontane, sa vle di, san koulè fliyoresans, fliyoresans molekil fliyoresan nan selil la apre limyè. iradyasyon; b. Fluoresans karakteristik, sa vle di, fluoresans selil yo emèt apre yo fin kolore yo ansanm ak lank fliyoresan an sou limyè a, entansite fluoresans li fèb, epi longèdonn lan diferan de longèdonn lazè iradyasyon an. Siyal otofluoresans lan se yon siyal bri, ki ka entèfere ak diskriminasyon ak mezi siyal fluoresans espesifik nan pifò ka yo. Nan mezi imunositochimik, kijan pou amelyore rapò siyal-bri a se kle pou antikò fliyoresan ki gen nivo lyezon ki ba.
An jeneral, pi wo kontni an nan molekil (egzanp, riboflavin, cytochrome, elatriye) ki ka pwodwi otofluoresans nan eleman selilè yo, se pi fò otofluoresans la.
An jeneral, plis molekil yo (pa egzanp, riboflavin, sitokrom, elatriye) ki ka pwodui otofluoresans nan konpozan selilè yo wo, se plis otofluoresans lan fò. Plis rapò selil mouri yo wo parapò ak selil vivan yo, se plis otofluoresans lan fò. Plis pwopòsyon selil klere yo wo nan echantiyon selil la, se plis otofluoresans lan fò. Mezi prensipal yo pou diminye entèferans otofluoresans epi amelyore rapò siyal-bri a se jan sa a: a. Chwazi lank fliyoresan klere otank posib; b. Chwazi lazè ki apwopriye a epi filtre sistèm optik; c. Kontribisyon otofluoresans lan konpanse pa yon sikwi konpansasyon elektwonik.
B. Prensip separasyon echantiyon an
Fonksyon klasman an nan sitomèt koule se yon seri selil ki fèt. Pwosesis la an jeneral se: kolòn likid ki soti nan bouch la divize an yon seri de ti gout dlo, dapre yon sèten paramèt chwazi pa sikwi lojik la pou detèmine si yo pral klase, ak Lè sa a, sikwi a chaje chaje ti gout selil yo chwazi, la. ti gout chaje pote selil nan jaden an elektwostatik ak devye, tonbe nan pèseptè a; Lòt likid yo aspire kòm fatra, ak kèk kalite enstriman tou itilize tib kaptire pou klasman.
Se ti gout ki estab ki fòme pa Vibration nan kristal piezoelectric sou chanm koule a anba aksyon an nan dè dizèn de kHz siyal elektrik, ki fòse koule nan likid kraze respire. Anjeneral, espas ti gout se sou dè santèn de μm. Fòmil anpirik eksperimantal f = v / 4.5d bay frekans siyal osilasyon ti gout dlo ki estab. Kote v se vitès koule likid la epi d se dyamèt twou bouch la. Li ka wè ke lè l sèvi avèk diferan orifis ak chanje vitès la koule ka chanje efè a klasman. Devyasyon nan ti gout yo klase ki gen selil yo nan jaden an elektwostatik akonpli pa kous la chaje ak plak la devyasyon. Vòltaj chaje a anjeneral + 150V oswa -150V; Diferans potansyèl ant plak defleksyon yo se dè milye vòlt. Dèlko a batman kè chaje nan kous la chaje kontwole pa kous la lojik, kidonk li pran yon peryòd de reta soti nan detèminasyon paramèt nan seleksyon lojik nan chaje batman kè, ki se jeneralman dè dizèn de ms. Detèminasyon egzat nan tan an reta se kle nan detèmine bon jan kalite a nan klasman. Se sikwi dijital la nan rejis chanjman an itilize pou jenere reta a. Li ka ajiste yon fason ki apwopriye selon kondisyon espesifik.
Sèvi ak sitomèt koule
Sitometri
A. Tès ak kalibrasyon
Sitometri koule yo ta dwe ak anpil atansyon ajiste anvan e menm pandan itilize asire fyab la ak optimite nan travay. Atik prensipal yo debogaj yo se entansite lazè, vitès koule likid, ak chemen an optik nan zòn nan mezi.
Entansite lazè: Anplis ajiste ang glas la pou ajiste limyè lazè a nan longèdonn vle a, li nesesè pou konbine koub spectre sou ekran ekspozisyon an pou maksimize pwodiksyon entansite lazè a.
Vitès koule likid: Li ka sipèvize pa yon ekspozisyon dijital sou tab la opere, epi presyon gaz la ka ajiste pou jwenn yon vitès likid koule ki estab.
Zòn mezi limyè chemen ajisteman: sa a se kle nan travay debogaj. Li nesesè asire ke koule nan likid, gwo bout bwa lazè, 90 simen mezi sistèm fotoelektrik nan zòn nan mezi se pèpandikilè orthogonal, ak pwen an entèseksyon se ti. An jeneral, li ka fè nan kalibrasyon ak estanda mikrosfè fluorescent.
Kantite a mezire nan sikometri koule se valè relatif, kidonk li nesesè pou kalibre oswa kalibre sistèm nan anvan oswa pandan itilizasyon, pou yo ka jwenn siyifikasyon absoli atravè mezi relatif. Se poutèt sa, kalibrasyon an nan FCM gen yon fonksyon doub: ajisteman aliyman enstriman ak dekale quantitative. Echantiyon STANDARD la ta dwe estab, fòm nan eleman tanjib lan ta dwe relativman inifòm ak esferik nan gwosè, pèfòmans dispèsyon echantiyon an bon, ak ekonomi an fasil jwenn. Mikwosfè fliyoresan estanda yo souvan itilize kòm echantiyon estanda ki pa byolojik ak globil wouj poul kòm echantiyon estanda byolojik. Mikwosfè yo fèt ak materyèl résine ak swa make avèk oswa san fluorescein. Pwosesis preparasyon echantiyon estanda globil wouj nan san poul yo te itilize te jan sa a: antikoagulan san poul ak 3.8% sitrat oswa eparin (anticoagulant: san poul = 1:4) te lave twa fwa ak PBS, Lè sa a, melanje ak 5 ~ 10ml. nan 1.0% glutaraldehyde epi lave ak pwòp globil wouj nan san poul apre souke nan tanperati chanm pou 24h. Finalman, li te lave ankò ak PBS epi estoke nan yon frijidè nan 4 ℃ pou itilize pita. Li ta dwe fè remake ke san yo pa tach fluoresans, siyal la limyè mezire se fliyoresans espontane nan emoglobin poul.
B. Operasyon ak itilizasyon enstriman yo
a. Limen kouran an epi chofe sistèm nan davans.
b. Louvri papòt gaz la, ajiste presyon an, epi jwenn vitès koule likid ki apwopriye a; Limen sistèm refwadisman sous limyè a.
c. Ajoute dlo deyonize nan tib echantiyon an, rense sistèm bouch la.
d. Sèvi ak echantiyon estanda kalibrasyon an, ajiste enstriman an pou entansite fliyoresans 0 ak 90 dispèsyon an pi wo a, epi koyefisyan varyasyon an dwe minimòm nan, sou baz puisans lazè a, vòltaj tib fotomiltiplikatè a ak genyen sikwi anplifikatè a.
e. Chwazi to koule a, mezi kantite selil yo, paramèt mezi yo, elatriye, nan menm kondisyon travay yo pou mezire echantiyon an ak echantiyon kontwòl la; An menm tan, chwazi mòd ekspozisyon done yo sou ekran òdinatè a, pou w ka konprann pwosesis mezi a entwitivman.
f. Apre yo fin mezire echantiyon an, yo itilize dlo deyonize pou rense sistèm koule likid la.
g. Paske done eksperimantal yo te estoke nan disk di òdinatè a (gen kèk machin ki gen yon sistèm CD-ROM tou, kidonk kapasite depo a pi gwo), ou ka fèmen gaz la, ak aparèy mezi a, epi sèvi ak yon òdinatè poukont li pou trete done yo.
h. Enprime rezilta yo mande yo.
C. Prekosyon nan operasyon ak itilizasyon
a. Tib fotomiltiplikatè a bezwen kondisyon travay ki estab. Apre ekspozisyon a limyè fò, li bezwen yon bon bout tan "adaptasyon nan fènwa" pou elimine oswa diminye yon pati nan kouran fènwa background nan anvan li ka fonksyone. Epitou, peye atansyon sou pwoteksyon mayetik la.
b. Pa dwe etenn epi limen sous limyè a pou yon ti tan (anjeneral apeprè 1 èdtan); Lè w ap itilize sous limyè a, fòk ou chofe l alavans epi peye atansyon pou wè si sistèm refwadisman an ap fonksyone byen.
c. Sistèm koule likid la dwe rete lis tout tan pou evite anbolisasyon ak ti boul, epi likid ki itilize a dwe filtre epi dezenfekte anvan ou itilize li.
d. Fè atansyon ak seleksyon sistèm filtè ki apwopriye a ak kalite anplifikatè a selon transfòmasyon objè mezi a.
e. Yo mete yon anfaz espesyal sou nesesite pou yon gwoup kontwòl pou chak mezi.
Kijan pou achte yon sitomèt koule?
Si ou enterese nan nou an Sitomèt koule oswa ou gen nenpòt kesyon, tanpri ekri yon imèl bay info@antiteck.com, nou pral reponn ou pi vit ke posib.