Jounal Pwosedi ELISA ka apeprè divize an twa pwosesis. Sa yo se konsepsyon pwotokòl ELISA, entèpretasyon done inisyal ELISA, ak kalkil rezilta ELISA.
Catalogue: Ekipman-pou-Elisa-Kit-Fabrication
Yon byen panse-soti ak pafè ELISA konsepsyon pwotokòl eksperimantal mande pou aranjman rasyonèl divès faktè eksperimantal ak kontwòl strik nan erè eksperimantal, kidonk evite fatra nan resous imen, materyèl, ak finansye ki te koze pa avèg fè eksperyans.
Anjeneral, nou rekòmande pou de premye kolòn nan plak 96 mikrotiter yo itilize pou eksperyans ELISA yo dwe mete kanpe kòm pi tach estanda, pandan y ap mete kanpe 8 konsantrasyon gradyan, 2 kolòn nan pwi konpoze, epi ajoute solisyon an k ap travay estanda soti nan konsantrasyon ki ba ak segondè. , sekans soti anba a nan tèt la nan plak la estanda anzim.
Dènye 10 kolòn plak microtiter yo ka mete kanpe kòm echantiyon tach pwi pou echantiyon yo dwe teste, epi jeneralman mete kanpe 2 pwi kopi. Dapre kondisyon eksperimantal yo, yo ka mete yon gwoup nòmal, gwoup modèl, gwoup tretman, elatriye.
Precision: Presizyon an nan yon Esè imunosorban ki lye ak anzim reflete repwodiksyon done yo mezire. Precision jeneralman eksprime pa koyefisyan varyasyon CV (CV = devyasyon estanda / vle di × 100%). An jeneral, CV nan estanda a ak echantiyon OD a ta dwe ≤ 10%.
Valè OD: Valè OD nan pi vid la nan ELISA se ≤ 0.1 (metòd sandwich). OD maksimòm estanda a se ≥1.2. OD echantiyon an ta dwe tonbe nan ranje koub estanda a.
Ranje lineyè: R2 ≥ 0.99 pou koyefisyan korelasyon regression lineyè koub estanda a.
Kòm dènye etap la nan Eksperyans ELISA, kalkil rezilta tès yo trè enpòtan pou tout eksperyans la.
Nou pran metòd sandwich la kòm yon egzanp pou prezante kalkil rezilta eksperyans ELISA.
Echantiyon ELISA anjeneral oblije mete kanpe 1 ~ 2 pwi kopi pou fè tès, ak valè an mwayèn nan absorpsyon nan estanda ak echantiyon gwoup eksperimantal yo sòti respektivman. Valè deteksyon yon sèl echantiyon pa ta dwe depase 20% valè mwayèn.
Valè mwayèn OD (absorbans) echantiyon ELISA yo ta dwe soustraksyon nan valè mwayèn OD lè konsantrasyon estanda a se 0.
Etabli koub estanda a: anfòm yon koub fonksyon lojistik nan kat paramèt sou yon trase kowòdone logaritmik (konsantrasyon estanda sou aks X la ak valè OD ki koresponn lan sou aks Y la). Rekòmande lè l sèvi avèk lojisyèl orijin.
Etap 1: Antre konsantrasyon estanda ak valè OD
Etap 2: Chwazi ki kalite koub yo dwe ekipe - ki pa lineyè koub Fitting
Etap 3: Chwazi Estatistik ak Lojistik, tcheke "Jwenn X nan Y"
Etap 4: Gade enfòmasyon sou koub estanda ELISA (egzanp valè paramèt, R-Square, elatriye)
Etap 5: Modifye tit kowòdone orizontal ak vètikal yo epi mete kalite aks la sou logaritmik
Double-klike sou graf ELISA anfòm nan etap 4 epi modifye li. Double-klike sou tit la nan kowòdone orizontal ak vètikal modifye, doub-klike sou aks X ak aks Y, mete kalite kowòdone nan "Log10", epi mete seri kowòdone orizontal ak vètikal la.
Etap 6: Kalkile echantiyon konsantrasyon nan koub estanda a
Chwazi katriyèm fèy travay la (Fit NL Find X from Y1), antre valè OD echantiyon an nan kolòn gòch la, epi konsantrasyon ki koresponn lan pral otomatikman pwodwi nan kolòn dwat la.
Omwen pwen sa yo ta dwe metrize lè w ap fè eksperyans ELISA.
Konpozisyon debaz la nan tès imunosorban ki lye ak anzim kontwòl pozitif yo ta dwe menm jan ak echantiyon tès la osi lwen ke posib. Anjeneral, kontwòl pozitif yo sitou baze sou yon tanpon ki gen yon pwoteksyon pwoteyin epi ajoute yon sèten kantite sibstans ki sou yo dwe teste. Pou egzanp, pou detèminasyon an nan serom imen kòm echantiyon an, se kontwòl la pozitif sitou fèt nan detèmine serom pasyan oswa konpoze kalsyòm plasma imen ak yon sèten kantite estanda.
Konpozisyon debaz la nan ELISA kontwòl negatif ta dwe tou konsistan avèk konpozisyon echantiyon tès la osi lwen ke posib, epi li pi bon pou teste an premye pou detèmine ke li pa gen sibstans ki sou yo dwe teste a. Pou egzanp, lè w teste echantiyon serom imen, kontwòl negatif yo ta dwe nòmal serom imen; lè w teste pisans antikò nan serom bèt iminize yo, kontwòl negatif yo ta dwe serom pre-iminitè bèt la.
Seleksyon antijèn ankapsule
Antijèn ankapsule yo ka divize an twa kategori: pwoteyin natirèl, pwoteyin recombinant, ak ti antijèn molekil. Pwoteyin natirèl yo bezwen pirifye pou yo kouvwi pa metòd adsorption dirèk la, pou antijèn ki gen plis enpurte ka kouvwi pa metòd kaptire endirèk (premye itilize sibstans ki ka reyaji ak antijèn sib la tankou antikò dirèkteman adsorbe sou plak estanda anzim la, ak Lè sa a, fè antijèn faz solid la pa reyaksyon espesifik). Pwoteyin recombinant pirifye jeneralman ka kouvri dirèkteman. Ti antijèn molekil tankou peptides ak kèk ti molekil konpoze òganik yo souvan difisil pou adsorbe dirèkteman sou plak anzim la akòz ti pwa molekilè yo epi yo jeneralman makonnen ak pwoteyin ki pa gen rapò tankou BSA, ak koup yo adsorbed sou transpòtè faz solid la.
Chwa solisyon kouch
Solisyon kouch ELISA a se nòmalman yon tanpon kabonat pH 9.6, oswa yon tanpon fosfat pH 7.2 si antijèn an enstab nan kondisyon alkalin.
Seleksyon tanperati kouch ELISA
Tanperati kouch ELISA a anjeneral 4-8 degre Sèlsiyis lannwit lan oswa 37 degre Sèlsiyis pou 2 èdtan, nou rekòmande pou 4-8 degre Sèlsiyis pou antretyen nan aktivite pwoteyin.
Seleksyon nan konsantrasyon kouch ELISA
Konsantrasyon pi gwo ELISA kouch varye ak nati solid faz konpayi asirans lan ak kouch, jeneralman, konsantrasyon nan kouch nan pwoteyin se 1-5ug / ml, presize konsantrasyon nan kouch pi gwo pou yon antijèn kouch espesifik bezwen yo dwe detèmine pa eksperyans.
Si fèmti nesesè depann de mòd ELISA ak kondisyon eksperimantal espesifik yo. Anjeneral pale, pou doub tès sandwich antikò, osi lontan ke makè anzim la trè aktif epi operasyon an byen lave, rezilta satisfezan ka jwenn san yo pa fèmen. Kontrèman, nan tès endirèk, kontajman se jeneralman esansyèl.
Selans yo souvan itilize yo se 0.05% -0.5% BSA, 10% serom estati ti towo bèf, 1% jelatin, ak 5% poud lèt ekreme, AbMART rekòmande pou itilize 5% poud lèt ekreme, ki pa chè epi ki gen gwo kapasite sele, sepandan, 5. % poud lèt ekreme se sèlman apwopriye pou itilize kout tèm epi li pa ta dwe estoke pou yon tan long, kidonk li se mwens itilize nan twous la.
Dilusyon nan konjige anzim yo
Konsantrasyon segondè nan pwoteyin etranje (egzanp 1% BSA oswa 5% poud lèt ekreme) yo souvan ajoute nan diluan an anpeche adsorption a ki pa espesifik nan konjige anzim sou konpayi asirans nan faz solid pa konpetisyon. Yon surfactant ki pa iyonik ki kapab anpeche adsorption pwoteyin sou sifas plastik la, tankou Tween 20 (konsantrasyon 0.05% pi pito), jeneralman ajoute.
Bon dilution nan konjige anzim yo
Konsantrasyon k ap travay apwopriye nan konjige anzim lan bezwen detèmine pa eksperyans pre-. Twò wo yon konsantrasyon gen tandans mennen nan background segondè, pandan y ap twò ba yon konsantrasyon ap mennen nan yon febli nan siyal la pozitif.
Konjige anzim lan ta dwe de preferans dilye anvan ou itilize, ak konjige anzim dilye a pa ta dwe estoke pou yon tan long, paske konsantrasyon ki ba nan konjige anzim yo trè sansib a inaktivasyon.
| Kesyon | Kòz ki posib | Solisyon |
|---|---|---|
| Kontwòl negatif yo bay rezilta pozitif | 1. Kontaminasyon reyaktif oswa consommables 2. Pwoblèm ak lave plak 3. Si pwoblèm nan rive nan metòd sandwich doub antikò, li posib ke gen yon reyaksyon kwa ant antikò a kouch ak antikò segondè a. 4. Itilizasyon twòp antikò | 1. Chanje reyaktif, lè l sèvi avèk founiti jetab 2. Chanje solisyon lave a ak fòmil pi fò, ogmante kantite lave plak epi pwolonje tan lave plak la. 3. Ranplasman antikò kouvwi oswa antikò segondè 4. Diminye kantite antikò yo itilize. |
| Tout tablo a parèt segondè background | 1. Antikò segondè pwodui adsorption ki pa espesifik 2. Solisyon chromogenic pa fre 3. Reyaksyon devlopman koulè a pa sispann pou twò lontan 4. Kontaminasyon reyaktif oswa consommables 5. Adsorption ki pa espesifik akòz tanperati reyaksyon segondè Adsorption ki pa espesifik akòz move kondisyon pou kenbe | 1. Diminye kantite antikò segondè yo itilize, diminye tan reyaksyon segondè antikò 2. Sèvi ak solisyon devlopman koulè pare 3. Kontwole tan reyaksyon an nan devlopman koulè, epi mete fen nan reyaksyon an nan tan 4. Chanje reyaktif epi sèvi ak consommables jetab 5. Fè egzateman kontwole reyaksyon an nan tanperati ki pi gwo 6. Ranplase solisyon an bloke ak yon solisyon bloke pi pwisan ak pwolonje tan an bloke |
| Ba siyal reyaksyon | 1. Kondisyon kouch ki pa apwopriye 2 .Reaksyon ensifizan nan antijèn ak antikò 3. Move fòmilasyon koulè devlope solisyon 4. Ensifizan segondè antikò obligatwa | 1. Ogmante konsantrasyon plak la, pwolonje tan plak la 2. Pwolonje tan reyaksyon an pou asire ke reyaksyon an te pote soti nan tanperati optimal ak ogmante kantite substra kwomojèn. 3. Ogmante konsantrasyon nan antikò segondè, pwolonje tan reyaksyon an, epi ranplase antikò segondè a ak yon sèl ki pi efikas. |
| Gradyan dilution fè ELISA pwodui fenomèn sote twou | 1. Transfè chalè inegal akòz anpile nan plak anzim, diferans ki genyen nan tanperati reyaksyon nan chak byen 2. Pipèt dilution pa kenbe kontinwite 3. Evaporasyon solisyon reyaksyon 4. Lave plak inegal 5. Gen debri oswa ti gout dlo sou pati anba plak anzim la | 1. Evite anpile plak yo ansanm otank posib 2. Kalite pipèt la regilyèman pou asire w itilize pipèt la kòrèkteman 3. Sele oswa kouvri plak yo ak yon sele 4. Asire w ke machin pou lave plak la ap travay byen epi netwaye plak yo lè w ap li |
