Ċitometru tal-Fluss

Ċitometru tal-fluss huwa mezz għall-analiżi awtomatika u l-għażla taċ-ċelloli. Jista 'jkejjel, jaħżen u juri malajr serje ta' parametri karatteristiċi bijofiżiċi U bijokimiċi importanti ta 'ċelluli mxerrda sospiżi f'likwidu, u jista' jikklassifika s-sottosettijiet ta 'ċelluli speċifikati skont il-firxa ta' parametri magħżula minn qabel. Il-biċċa l-kbira taċ-ċitometri tal-fluss huma strumenti b'riżoluzzjoni żero, li jistgħu jkejlu biss l-ammont totali ta 'aċidu nuklejku, proteina totali, u indikaturi oħra ta' ċellula, iżda ma jistgħux jidentifikaw u jiskopru l-ammont ta 'aċidu nuklejku jew proteina f'parti partikolari. Fi kliem ieħor, għandu riżoluzzjoni ta 'dettall żero.

Kejl multi-parametri jista 'jitwettaq simultanjament minn ċitometrija tal-fluss, u l-informazzjoni tiġi prinċipalment minn sinjali ta 'fluworexxenza speċifiċi u sinjali ta' tifrix mhux fluworexxenti. Il-kejl jitwettaq fiż-żona tal-kejl, l-hekk imsejħa żona tal-kejl hija l-punt ta 'intersezzjoni vertikali tar-raġġ tal-lejżer u r-raġġ tal-fluss likwidu li joħroġ iż-żennuna. Meta ċellula waħda fiċ-ċentru tal-fluss tal-likwidu tgħaddi miż-żona tal-kejl, hija irradjata bil-laser u tferrex id-dawl għall-ispazju kollu b'Angolu solidu ta '2π. Il-wavelength tad-dawl imxerred huwa l-istess bħall-wavelength tad-dawl inċidentali. L-intensità u d-distribuzzjoni spazjali tad-dawl imxerred huma relatati mill-qrib mad-daqs, il-morfoloġija, il-membrana tal-plażma u l-istruttura interna taċ-ċellula minħabba li dawn il-parametri bijoloġiċi huma relatati mal-proprjetajiet ottiċi taċ-ċellula, bħar-riflessjoni u r-rifrazzjoni tad-dawl. Iċ-ċelloli li ma sofrew l-ebda ħsara għandhom it-tifrix tad-dawl karatteristiku, għalhekk sinjali differenti tad-dawl imxerrda jistgħu jintużaw biex janalizzaw u jagħżel iċ-ċelloli ħajjin mingħajr tbajja. Is-sinjal tad-dawl imxerred ta 'ċelloli fissi u mtebbgħin huwa ċertament differenti minn dak ta' ċelloli ħajjin minħabba l-proprjetajiet ottiċi mibdula. Id-dawl imxerred mhux biss huwa relatat mal-parametri taċ-ċellula bħala ċ-ċentru tat-tifrix, iżda wkoll ma 'fatturi abijotiċi bħall-Angolu tat-tifrix u l-Angolu solidu li fih jinġabar id-dawl imxerred.

In ċitometrija tal-fluss kejl, żewġ tipi ta 'dawl imxerred huma komunement użati: a. Angolu 'l quddiem (0 Angle) tifrix (FSC); b. It-tifrix tal-ġenb (SSC), magħruf ukoll bħala 90 Angle tifrix. L-Angolu msemmi hawn jirreferi għall-Angolu bejn wieħed u ieħor iffurmat bejn id-direzzjoni tar-raġġ tal-lejżer u d-direzzjoni axjali tat-tubu fotomultiplikatur li jiġbor is-sinjal tad-dawl imxerred. B'mod ġenerali, l-intensità tad-dawl imxerred Angolu 'l quddiem hija relatata mad-daqs taċ-ċelloli u tiżdied biż-żieda ta' żona ta 'sezzjoni trasversali taċ-ċelluli għall-istess popolazzjoni taċ-ċelluli. L-esperimenti fuq ċelloli sferiċi ħajjin juru li huwa bażikament lineari mad-daqs taż-żona trasversali fil-medda ta 'Angolu solidu żgħir. Il-forma kumplessa u l-orjentazzjoni taċ-ċellula jistgħu jkunu differenti ħafna, speċjalment jeħtieġ li tingħata attenzjoni. Il-kejl tad-dawl imxerred fil-ġenb jintuża prinċipalment biex tinkiseb informazzjoni dwar il-proprjetajiet granulari tal-istruttura interna fina taċ-ċellula. Għalkemm id-dawl imxerred fil-ġenb huwa wkoll relatat mad-daqs u l-għamla taċ-ċellula, huwa aktar sensittiv għall-indiċi refrattiv tal-membrana taċ-ċellula, ċitoplasma u membrana nukleari, u jista 'wkoll jagħti rispons sensittiv għall-partiċelli akbar fil- ċitoplasma.

Fil-prattika, l-istrument għandu l-ewwel ikejjel is-sinjal li jxerred id-dawl. Meta tintuża flimkien ma 'sondi fluworexxenti, l-analiżi tat-tifrix tad-dawl tista' tiddistingwi ċelluli mtebbgħin u mhux imtebbgħin f'kampjun. L-aktar użu effettiv tal-kejl tat-tifrix tad-dawl huwa li jiġu identifikati ċerti sottogruppi minn popolazzjonijiet eteroġenji. Is-sinjal tal-fluworexxenza jinkludi prinċipalment żewġ partijiet: a. Fluworexxenza spontanja, jiġifieri, mingħajr tbajja ta 'fluworexxenza, il-fluworexxenza ta' molekuli fluworexxenti fiċ-ċellula wara l-irradjazzjoni tad-dawl; b. Fluworexxenza karatteristika, jiġifieri, il-fluworexxenza emessa miċ-ċelloli wara t-tebgħa flimkien maż-żebgħa fluworexxenti fuq id-dawl, l-intensità tal-fluworexxenza tagħha hija dgħajfa, u l-wavelength hija differenti minn dik tal-laser tal-irradjazzjoni. Is-sinjal ta 'awtofluworexxenza huwa sinjal ta' storbju, li jista 'jinterferixxi mad-diskriminazzjoni u l-kejl ta' sinjali ta 'fluworexxenza speċifiċi f'ħafna każijiet. Fil-kejl tal-immunoċitokimika, kif ittejjeb il-proporzjon tas-sinjal għall-istorbju hija ċ-ċavetta għal antikorpi fluworexxenti b'livelli baxxi ta 'rbit.

B'mod ġenerali, iktar ma jkun għoli l-kontenut ta 'molekuli (eż., riboflavin, cytochrome, eċċ.) Li jistgħu jipproduċu awtofluworexxenza fil-komponenti ċellulari, iktar tkun b'saħħitha l-awtofluworexxenza.

B'mod ġenerali, iktar ma jkun għoli l-kontenut ta 'molekuli (eż., riboflavin, cytochrome, eċċ.) Li jistgħu jipproduċu awtofluworexxenza fil-komponenti ċellulari, iktar tkun b'saħħitha l-awtofluworexxenza. Iktar ma jkun għoli l-proporzjon ta 'ċelluli mejta għal ċelluli ħajjin, iktar tkun b'saħħitha l-awtofluworexxenza. Iktar ma jkun għoli l-proporzjon ta 'ċelluli jleqqu fil-kampjun taċ-ċellula, iktar tkun b'saħħitha l-awtofluworexxenza. Il-miżuri ewlenin biex titnaqqas l-interferenza tal-awtofluworexxenza u tittejjeb il-proporzjon tas-sinjal għall-ħoss huma kif ġej: a. Agħżel żebgħa fluworexxenti qawwi kemm jista 'jkun; b. Agħżel is-sistema ottika xierqa tal-laser u tal-filtru; c. Il-kontribuzzjoni fl-isfond ta 'awtofluworexxenza hija kkumpensata minn ċirkwit ta' kumpens elettroniku.

Il-funzjoni tal-issortjar tal- ċitometru tal-fluss hija mwettqa minn għażla taċ-ċelluli. Il-proċess ġenerali huwa: il-kolonna likwida miż-żennuna hija maqsuma f'serje ta 'qtar ta' ilma żgħir, skond ċertu parametru magħżul miċ-ċirkwit loġiku biex jiddetermina jekk hux se jiġi magħżul, u mbagħad iċ-ċirkwit tal-iċċarġjar jiċċarġja l-qtar taċ-ċelluli magħżula, il- qtar iċċarġjati jġorru ċelloli permezz tal-kamp elettrostatiku u jiddevjaw, jaqgħu fil-kollettur; Likwidi oħra huma aspirati bħala skart, u xi tipi ta 'strumenti jużaw ukoll tubi tal-qbid għall-għażla.

Il-qtar stabbli huwa ffurmat mill-vibrazzjoni tal-kristall pjeżoelettriku fuq il-kamra tal-fluss taħt l-azzjoni ta 'għexieren ta' sinjal elettriku kHz, li jġiegħel il-fluss tal-likwidu jinkiser b'mod uniformi. Ġeneralment, l-ispazjar tal-qtar huwa ta 'madwar mijiet ta' μm. Il-formula empirika sperimentali f = v / 4.5d tagħti l-frekwenza tas-sinjal ta 'oxxillazzjoni ta' qtar ta 'ilma stabbli. Fejn v hija l-veloċità tal-fluss tal-likwidu u d huwa d-dijametru tat-toqba taż-żennuna. Jista 'jidher li l-użu ta' orifiċi differenti u t-tibdil tal-veloċità tal-fluss jista 'jbiddel l-effett tal-issortjar. Id-deflessjoni tal-qtar magħżula li fihom iċ-ċelluli fil-kamp elettrostatiku titwettaq miċ-ċirkwit tal-iċċarġjar u l-pjanċa tad-deflessjoni. Il-vultaġġ tal-iċċarġjar huwa ġeneralment + 150V jew -150V; Id-differenza potenzjali bejn il-pjanċi tad-deflessjoni hija eluf ta 'volts. Il-ġeneratur tal-polz tal-iċċarġjar fiċ-ċirkwit tal-iċċarġjar huwa kkontrollat ​​miċ-ċirkwit loġiku, għalhekk jieħu perjodu ta 'dewmien mid-determinazzjoni tal-parametri permezz tal-għażla tal-loġika għall-iċċarġjar tal-polz, li ġeneralment huwa għexieren ta' ms. Determinazzjoni preċiża tal-ħin tad-dewmien hija ċ-ċavetta biex tiddetermina l-kwalità tal-għażla. Iċ-ċirkwit diġitali tar-reġistru taċ-ċaqliq jintuża biex jiġġenera d-dewmien. Jista 'jiġi aġġustat b'mod xieraq skont rekwiżiti speċifiċi.

Ċitometrija tal-fluss għandhom jiġu aġġustati bir-reqqa qabel u anke waqt l-użu biex jiġu żgurati l-affidabbiltà u l-ottimalità tax-xogħol. L-oġġetti ewlenin tad-debugging huma l-intensità tal-lejżer, il-veloċità tal-fluss tal-likwidu, u l-mogħdija ottika taż-żona tal-kejl.

Intensità tal-lejżer: Minbarra l-aġġustament tal-Angolu tal-mera biex taġġusta d-dawl tal-lejżer għall-wavelength mixtieq, huwa meħtieġ li tgħaqqad il-kurva tal-ispettru fuq l-iskrin tal-wiri biex timmassimizza l-output tal-intensità tal-laser.

Veloċità tal-fluss tal-likwidu: Tista 'tiġi sorveljata minn wirja diġitali fuq il-mejda operattiva, u l-pressjoni tal-gass tista' tiġi aġġustata biex tinkiseb veloċità stabbli tal-fluss tal-likwidu.

Aġġustament tal-passaġġ tad-dawl taż-żona tal-kejl: din hija ċ-ċavetta għax-xogħol ta 'debugging. Huwa meħtieġ li jiġi żgurat li l-fluss likwidu, raġġ tal-lejżer, 90 sistema fotoelettrika tal-kejl tat-tifrix fiż-żona tal-kejl tkun ortogonali perpendikolari, u l-punt ta 'intersezzjoni huwa żgħir. B'mod ġenerali, jista 'jsir fil-kalibrazzjoni ma' mikrosferi fluworexxenti standard.

Il-kwantità mkejla fiċ-ċitometrija tal-fluss hija valur relattiv, għalhekk huwa meħtieġ li s-sistema tiġi kkalibrata jew ikkalibrata qabel jew waqt l-użu, sabiex is-sinifikat assolut ikun jista 'jinkiseb permezz ta' kejl relattiv. Għalhekk, il-kalibrazzjoni fl-FCM għandha funzjoni doppja: aġġustament tal-allinjament tal-istrumenti u skalar kwantitattiv. Il-kampjun STANDARD għandu jkun stabbli, il-forma tal-komponent tanġibbli għandha tkun relattivament uniformi u sferika fid-daqs, il-prestazzjoni tad-dispersjoni tal-kampjun hija tajba, u l-ekonomija hija faċli biex tinkiseb. Mikrosferi fluworexxenti standard huma komunement użati bħala kampjuni standard mhux bijoloġiċi u ċelluli ħomor tad-demm tat-tiġieġ bħala kampjuni standard bijoloġiċi. Il-mikrosferi huma magħmula minn materjal tar-reżina u jew ittikkettjati bi jew mingħajr fluworexxeina. Il-proċess ta 'preparazzjoni tal-kampjun standard ta' ċelluli ħomor tad-demm tat-tiġieġ użat kien kif ġej: antikoagulant tad-demm tat-tiġieġ bi 3.8% ċitrat jew eparina (antikoagulant: demm tat-tiġieġ = 1:4) inħasel tliet darbiet b'PBS, imbagħad imħallat ma '5 ~ 10ml ta '1.0% glutaraldehyde u maħsula b'ċelluli ħomor tad-demm tat-tiġieġ imnaddfa wara li tħawwad f'temperatura tal-kamra għal 24 siegħa. Fl-aħħarnett, reġa' nħasel bil-PBS u nħażen fi friġġ f'4℃ għal użu aktar tard. Għandu jiġi rrilevat li mingħajr tbajja ta 'fluworexxenza, is-sinjal tad-dawl imkejjel huwa l-fluworexxenza spontanja ta' l-emoglobina tat-tiġieġ.

a. Ixgħel il-qawwa u saħħan minn qabel is-sistema.

b. Iftaħ il-limitu tal-gass, aġġusta l-pressjoni, u tikseb il-veloċità xierqa tal-fluss tal-likwidu; Ixgħel is-sistema tat-tkessiħ tas-sors tad-dawl.

c. Żid ilma dejonizzat mat-tubu tal-kampjun, laħlaħ is-sistema taż-żennuna.

d. Bl-użu tal-kampjun standard tal-kalibrazzjoni, aġġusta l-istrument sabiex l-intensità tal-fluworexxenza ta '0 u 90 tifrix tkun l-ogħla, u l-koeffiċjent tal-varjazzjoni huwa meħtieġ li jkun il-minimu, fuq il-bażi tal-qawwa tal-lejżer, il-vultaġġ tat-tubu fotomultiplikatur u il-gwadann taċ-ċirkwit amplifikatur.

e. Ir-rata tal-fluss magħżula, il-kejl tan-numru taċ-ċelluli, il-parametri tal-kejl, eċċ., Fl-istess kundizzjonijiet tax-xogħol biex jitkejjel il-kampjun u l-kampjun ta 'kontroll; Fl-istess ħin, agħżel il-mod tal-wiri tad-dejta fuq l-iskrin tal-kompjuter, sabiex taqbad b'mod intuwittiv il-proċess tal-kejl.

f. Wara li jitkejjel il-kampjun, jintuża ilma dejonizzat biex titlaħlaħ is-sistema tal-fluss tal-fluwidu.

g. Minħabba li d-dejta sperimentali ġiet maħżuna fil-hard disk tal-kompjuter (xi magni għandhom ukoll sistema ta 'CD-ROM, għalhekk il-kapaċità tal-ħażna hija akbar), sabiex tkun tista' tagħlaq il-gass, u apparat tal-kejl, u tuża kompjuter waħdu għall-ipproċessar tad-data.

h. Stampa r-riżultati meħtieġa.

a. It-tubu fotomultiplikatur jeħtieġ kundizzjonijiet tax-xogħol stabbli. Wara l-espożizzjoni għal dawl qawwi, jeħtieġ żmien twil ta '"adattament skur" biex telimina jew tnaqqas parti mill-isfond tal-kurrent skur qabel ma tkun tista' taħdem. Oqgħod attent ukoll għall-ilqugħ manjetiku.

b. Is-sors tad-dawl m'għandux jintefa u jinxtegħel fi żmien qasir (ġeneralment madwar 1h); L-użu tas-sors tad-dawl għandu jkun imsaħħan minn qabel u tagħti attenzjoni li s-sistema tat-tkessiħ qed taħdem b'mod normali.

c. Is-sistema tal-fluss tal-likwidu għandha tinżamm bla xkiel fi kwalunkwe ħin biex tiġi evitata l-embolizzazzjoni tal-bużżieqa, u l-fluwidu tal-għant użat għandu jiġi ffiltrat u diżinfettat qabel l-użu.

d. Oqgħod attent għall-għażla ta 'sistema ta' filtru xierqa u tip ta 'amplifikatur skont it-trasformazzjoni tal-oġġett tal-kejl.

e. Tpoġġiet enfasi speċjali fuq il-ħtieġa ta' grupp ta' kontroll għal kull kejl.

Jekk inti interessat tagħna ċitometru tal-fluss jew għandek xi mistoqsijiet, jekk jogħġbok ikteb e-mail lil [protett bl-email], aħna se nwieġbuk kemm jista 'jkun malajr.