Barraxa taċ-ċelluli u Lifter taċ-ċelluli
Barraxa taċ-ċelluli Vs. lifter taċ-ċelluli
Kemm barraxa taċ-ċelluli u, lifter taċ-ċelluli jintużaw primarjament biex jiġbru ċ-ċelloli. Ix-xafra tagħhom hija mfassla biex tnaqqas ħafna l-ħsara liċ-ċelloli u tippermetti aċċess għall-wiċċ tat-tkabbir. Ix-xafra ġeneralment tkun magħmula minn materjal polimeru TPE, u l-hilt ġeneralment ikun magħmul minn materjal polimeru ABS. Dawn il-materjali huma adattati għall-ħsad taċ-ċelloli.
lifter taċ-ċelluli hija prinċipalment iddisinjata għall-użu fi kultura taċ-ċelluli platti għat-tarf ċanfrin wiesa 'tagħha.
Barraxa taċ-ċelluli b'xafra angolata u li ddur għal aċċess faċli għall-wiċċ tat-tkabbir tal-garafini u d-dixxijiet Petri.
Karatteristiċi ta 'cell scrape & cell lifter
a. Għall-ħsad manwali taċ-ċelloli.
b. Id-disinn tax-xafra jagħmel kuntatt bla xkiel mal-wiċċ tat-tkabbir, u dan jirriżulta f'ħsara minima liċ-ċelloli.
ċ. Gamma sterilizzazzjoni bir-radjazzjoni.
d. Mhux piroġeniku, mhux endotossiku, mhux ċitotossiku.
e. Tulijiet differenti ta' mankijiet tas-sikkina jissodisfaw ir-rekwiżiti għall-kultivazzjoni ta' kollezzjonijiet differenti ta' kulturi taċ-ċelloli.
f. Imgeżwer individwalment.
g. Fliexken tal-laboratorju disponibbli.
h. Daqs differenti għall-għażliet: 18cm, 25cm, 40cm, mini-barraxa taċ-ċelluli, Eċċ
i. Użat ma' pjanċi tal-bjar, bħal barraxa taċ-ċelluli għal pjanċa ta '24 tajjeb, barraxa taċ-ċelluli għal pjanċa ta '12 tajjeb, Eċċ
Applikazzjonijiet ta 'cell scrape & cell lifter
Fl-industrija farmaċewtika, kultura taċ-ċelluli sar komponent importanti tal-produzzjoni tal-antikorpi. It-teknoloġija tal-kultura taċ-ċelluli ntużat biex tipproduċi antikorpi relatati ma 'rotavirus, poljo, ġidri, epatite, rubella, u varicella. Antikorpi bbażati fuq iċ-ċelluli kontra l-influwenza ġew ukoll approvati għall-użu fl-Istati Uniti u ħafna pajjiżi Ewropej. Hawn huma ftit eżempji ta jinbarax taċ-ċelluli & lifter taċ-ċelluli applikazzjonijiet.
Kultivazzjoni tal-passaġġ taċ-ċelluli
It-tkabbir u l-proliferazzjoni taċ-ċelloli mkabbra mal-ħajt huma mxekkla mill-fatt li l-ispazju huwa fil-biċċa l-kbira saturat wara l-kultura. garafina jew id-dixx tal-kultura kiber għal firxa ta' saff wieħed. Kultivazzjoni tal-passaġġ taċ-ċelluli titwettaq biex jippermetti espansjoni jew tkabbir kontinwu taċ-ċelluli. Ukoll, il-kulturi li jgħaddu jservu biex jippreservaw ċellula speċi. Barra minn hekk, varjetà ta 'esperimenti taċ-ċelluli huma bbażati fuq il-kultivazzjoni tal-passaġġ taċ-ċelluli.
Iċ-ċelloli sospiżi jistgħu jinqasmu direttament fi fliexken, filwaqt li ċ-ċelloli bil-ħitan jeħtieġ li jiġu diġeriti u trattamenti oħra qabel ma jkunu jistgħu jinqasmu fi fliexken. Trypsin huwa ġeneralment użat biex jiddiġerixxi ċ-ċelloli aderenti f'ċelloli individwali, u EDTA jista 'jiġi miżjud ukoll biex ittejjeb id-diġestjoni. EDTA huwa chelator ta 'joni divalenti li jinibixxi Ca2+ u Mg2+ fuq il-membrana taċ-ċellula. Is-soluzzjoni tad-diġestjoni taċ-ċelluli użata komunement ġeneralment fiha 0.25% (w/v) trypsin u 0.03% (w/v) EDTA.
Matul l-esperiment, għandek taspira s-supernatant tal-kultura taċ-ċelluli, aħsel iċ-ċelloli b'PBS, armi s-soluzzjoni tal-ħasil, u żid mill-ġdid ammont żgħir ta 'soluzzjoni ta' diġestjoni trypsin-EDTA. Skont id-daqs tad-dixx tal-kultura, 2 ml sa 5 ml ta 'soluzzjoni tad-diġestjoni huma biżżejjed biex jinfirxu l-qiegħ kollu tad-dixx. Iċ-ċelloli mbagħad jiġu osservati sakemm isiru tondi u jinqalgħu mill-ħajt tal-flixkun, li normalment jieħu 3-5 minuti. Biex tevita l-ġbir taċ-ċelloli, m'għandekx tisfrutta l-flask waqt il-proċess tad-diġestjoni. Għal ċelloli li huma partikolarment diffiċli biex jiġu diġeriti, tista 'żżid soluzzjoni ta' diġestjoni ta 'trypsin EDTA u mbagħad poġġi ċ-ċelloli f'37 ° C biex tiffaċilita d-diġestjoni. Wara li ċ-ċelloli jkunu nqalgħu mill-ħajt tal-flixkun, għandek immedjatament iżżid medju sħiħ li fih is-serum biex twaqqaf id-diġestjoni.
Iċċentrifuga iċ-ċelloli b'veloċità ta' 800-1000 rpm għal 5 minuti. Imbagħad armi l-mezz li ma ntużax, żid mezz ġdid adattat u ħawwad bil-mod iċ-ċelloli u ittrasferihom għal flixkun tal-kultura ġdid. Il-perċentwal ta' passaġġ jiddependi mit-tip ta' ċellula. It-tripsina tista' tikkawża ħsara lill-membrana taċ-ċellula ta' xi ċelloli. Għal dan it-tip ta' ċelloli, tista' tobroxhom bil-mod b'għodda cellscraper, żid l-ammont xieraq ta 'medju, daqqa bil-mod biex tħallat iċ-ċelloli, u mbagħad għaddihom mill-kultura.
Estrazzjoni ta 'proteini ċellulari
A. Tħejjija tal-esperiment
a. Ikkonferma li l- magna tas-silġ ikun mixgħul u li jkun hemm biżżejjed silġ imfarrak għall-użu waqt it-tħaddim.
b. Ikkonferma li l-magna tas-silġ hija mixgħula u li hemm biżżejjed silġ imfarrak għall-użu waqt it-tħaddim.
c. Ikkonferma li l-markatur tal-enzima qed jaħdem sew, agħmel appuntament u rreġistra qabel l-użu.
d. Ipprepara 4 settijiet ta' tubi taċ-ċentrifuga ta' 1.5 mL. Dawn jintużaw biex jiġbru s-sospensjoni taċ-ċelluli liżati, jiġbru s-supernatant tal-proteina wara ċ-ċentrifugazzjoni, jiddeterminaw il-konċentrazzjoni tal-kampjuni tal-proteina wara dilwizzjoni ta' 5 darbiet, u jiddeterminaw il-konċentrazzjoni tal-kampjuni tal-proteina wara dilwizzjoni ta' 10 darbiet.
e. Ipprepara s-soluzzjoni tal-liżi taċ-ċelluli.
Qabel l-użu, ħallat is-soluzzjoni tal-liżi taċ-ċelluli fil-proporzjon ta 'lysate 1mL: inibitur tal-protease (PMSF) 10μL. PMSF huwa effettiv fi żmien 30min, għalhekk oqgħod attent għall-preparazzjoni lesta għall-użu.
Ikkalkula l-ammont ta 'fluwidu operattiv li jeħtieġ li jiġi ppreparat minn qabel. L-ammont speċifiku ta 'fluwidu operattiv jeħtieġ li jiġi dehrit fuq bażi ta' każ b'każ. B'mod ġenerali, jekk iċ-ċelloli jilħqu 70 ~ 80% konfluwenza fi flixkun tal-kultura 25T, 250 ~ 350μL ta 'soluzzjoni tax-xogħol hija meħtieġa għall-użu. Jekk iżżid wisq soluzzjoni tal-liżi taċ-ċelluli, il-konċentrazzjoni tal-proteina tal-kampjun finali tista 'tkun baxxa wisq. Jekk tiġi miżjuda soluzzjoni insuffiċjenti ta 'liżi taċ-ċelluli, il-liżi taċ-ċelluli mhix biżżejjed u l-kampjun huwa simili li jwaħħal faċilment jimblokka l-ponta tal-pistola ta' 200 μL. Il-fluwidu operattiv tal-liżi taċ-ċelluli huwa rakkomandat li jiġi mkessaħ minn qabel f'4°C.
f. Ipprepara barraxa taċ-ċelluli u, lifters taċ-ċelluli. Mill-inqas 3 biċċiet minnhom biex jalternaw meta jinbarax iċ-ċelloli.
g. Ipprepara tlieta tazzi ta' volum ta' 100 mL jew akbar. Dawn il-beakers jeħtieġ li jinħaslu minn qabel u jimtlew b'ilma ultrapur. Jintużaw għall-ħasil sekwenzjali ta' użati barraxa taċ-ċelluli. Kemm il- barraxa taċ-ċelluli tal-gomma u, barraxa taċ-ċelluli tal-plastik huma disponibbli. Barraxa taċ-ċelluli tal-pulizija tal-gomma huwa aktar rakkomandat.
h. Ipprepara soluzzjoni tal-melħ f'ekwilibriju.
i. Ipprepara kit tal-analiżi tal-konċentrazzjoni tal-proteina BCA.
j. Ipprepara l-buffer tat-tagħbija tal-SDS. Dan jinħażen f'temperatura ta' -20℃ u għandu jinfetaħ minn qabel qabel l-użu.
B. Proċedura sperimentali
a. Wiċċ tal-bank tal-laboratorju pulit
Ma jimpurtax f'liema tip ta 'esperiment qed tagħmel, huwa essenzjali li żżomm il-mejda tal-operat tiegħek nadifa u pulita. Meta timmanipula esperimenti bħall-estrazzjoni tal-proteini jew l-estrazzjoni tad-DNA/RNA, huwa rakkomandat li topera f'tabella ultra-nadifa. Fin-nuqqas ta 'mejda ultra-nadifa, għandna niżguraw li l-mejda operattiva tkun pulita kemm jista' jkun. Ukoll, iż-żamma tal-mejda operattiva pulita hija vizzju tajjeb li jeħtieġ li jiġi żviluppat għal kwalunkwe operazzjoni sperimentali.
Meta jiġu kkonfermati l-istrumenti tal-laboratorju meħtieġa għall-esperiment, iċ-ċelloli jistgħu jitneħħew mill-kompartiment taċ-ċelluli.
b. Ħasil bil-PBS
Wara li tneħħi ċ-ċelloli, għandek taħsilhom b'PBS f'temperatura tal-kamra. Imbagħad l-operazzjonijiet kollha għandhom isiru fuq banju tas-silġ.
ċ. Liżi ċellulari
Żid 250 sa 350μL ta’ soluzzjoni ta’ liżi ma’ kull kunjett ta’ ċelloli. Il-lysate għandu jinfirex sew u lysed f'banju tas-silġ għal 10 min. Għandek tirrepeti biex tifrex il-lisat b'mod konsistenti matul dawn l-10 minuti. It-teknika tat-tixrid tal-lisat hija l-istess bħal għad-diġestjoni tat-tripsin. Waqt li tistenna l-liżi, għandek tikkonferma mill-ġdid it-temperatura taċ-ċentrifuga, it-termostat u l-banju tal-ilma.
d. Brix taċ-ċelloli
Wara li l-liżi tkun kompluta, għandek tobrox iċ-ċelloli billi tuża a barraxa taċ-ċelluli. Kull azzjoni ta 'brix taċ-ċelloli għandha tkun twaħħal b'soluzzjoni ta' liżi, u żżomm direzzjoni waħda minn fuq għal isfel, u l-azzjoni hija bħal brix u ħasil tal-ħġieġ.
e. Trasferiment ta' kampjuni
Uża pipetta ta' 200 μL biex tittrasferixxi s-sospensjoni taċ-ċelluli mibruxa għal kontenitur ta' 1.5 mL. tubu ċentrifugu (immedjatament wara li tobrox kampjun) u ripetutament nefaħ 30-60 darba biex tkisser iċ-ċelloli kompletament. Ipprova evita bżieżaq tal-arja waqt il-proċess tan-nefħa. Wara li jitlesta n-nefħa, it-tubu taċ-ċentrifuga bil-kampjun għandu jiddaħħal fuq is-silġ.
f. Irrepeti l-pass e. biex tlesti l-kollezzjonijiet tal-kampjuni
Għandek laħlaħ il- barraxa taċ-ċelluli u, lifter taċ-ċelluli użat fil-pass e. fi tliet beakers min-naħa tagħhom, ħawwad barraxa taċ-ċelluli bil-mod u daħħalhom fuq rack tat-tubu tat-test biex jinxef. Jekk lifters taċ-ċelluli ma jitnaddfux, dan jista' jwassal għal kontaminazzjoni inkroċjata tal-kampjuni. Jekk iċ-ċelloli ma jitnixxfux, jirriżulta f'dilwizzjoni tal-kampjun.
g. Liżi ulterjuri tal-banju tas-silġ
Wara li l-kampjuni huma kollha mibruxa u trasferiti għal tubi ċentrifugi, jitkomplew jiġu lysed f'banju tas-silġ għal 5-10 min. Matul dan il-perjodu, il-kundizzjoni taċ-ċentrifuga, it-termostat u l-banju ta 'l-ilma għandha tiġi kkonfermata mill-ġdid.
h. Ċentrifugazzjoni
Wara li titlesta l-liżi, ċentrifuga fi 12,000g, 4°C, għal 5 min.
i. Ġbir tas-supernatant tal-proteini
Ħu s-supernatant u użah għall-preparazzjoni tal-kejl tal-konċentrazzjoni tal-proteini u d-denaturazzjoni tal-kampjuni għall-WB. Meta tieħu s-supernatant tal-kampjun għal WB, jekk jogħġbok irreġistra l-volum tal-kampjun u żid il-volum korrispondenti tal-buffer tat-tagħbija SDS sussegwentement skont il-volum tal-kampjun biex tipprepara l-kampjun tat-tisjir.
C. Metodu BCA għad-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni tal-proteini
a. It-termostat għandu jissaħħan minn qabel għal 37°C minn qabel.
b. Ikkonfigura soluzzjoni ta' kwantifikazzjoni tal-proteini 5× u 10× u poġġiha fil-ġenb fuq is-silġ wara l-preparazzjoni. Hawnhekk huwa rakkomandat li tuża PBS għad-dilwizzjoni tal-kampjun, għaliex il-kulur ta' D-Hanks innifsu jista' jaffettwa r-riżultat finali tal-kwantifikazzjoni tal-konċentrazzjoni tal-proteini.
5 × dilwizzjoni: 80 μLPBS + 20 μL supernatant.
10 × dilwizzjoni: 90 μLPBS + 10 μL supernatant.
c. Ipprepara l-kit tal-kwantifikazzjoni tal-proteina BCA u kkalkula l-ammont totali ta' fluwidu operattiv kif meħtieġ. Ipprepara l-fluwidu operattiv skont l-istruzzjonijiet fil-proporzjon BCA: Cu= 50: 1. Tinsiex tħallat il-likwidu kompletament. Is-soluzzjoni tax-xogħol imħallta hija ta' kulur blu ċar u ċar.
d. Il-pjanċa ta' 96 bir hija mimlija b'20 μL għal kull bir, u jiġu ssettjati mill-inqas tliet bir replikati. Minħabba li l-kampjun tal-proteina huwa viskuż ħafna u l-volum imwaħħal huwa żgħir, il-ponta tal-pistola tista' tiġi estiża fil-bir u mdaħħla mal-qiegħ tal-bir biex titlesta l-kampjun imwaħħal billi tintuża t-tensjoni tal-likwidu.
e. Wara li titlesta ż-żieda tal-kampjun, kull bir tal-kampjun jiġi ssupplimentat b'200 μL tal-fluwidu operattiv. L-azzjoni taż-żieda tal-fluwidu operattiv għandha tkun rapida u nadifa. Iż-żieda rapida u nadifa tal-fluwidu operattiv tiffaċilita taħlit adegwat.
f. Inkuba għal 30 minuta f'temperatura ta' 37°C. Wara li titlesta r-reazzjoni, l-assaġġ għandu jitlesta fi żmien 3~5 minuti.
g. L-assorbenza titkejjel fit-tul ta' mewġa speċifikat permezz ta' markatur tal-enzima.
h. Il-konċentrazzjoni tal-proteina għandha tiġi kkalkulata skont l-ekwazzjoni tal-kurva standard li tkun ġiet ippreparata qabel. Ara l-istruzzjonijiet tal-kit għall-metodu ta' kif tiġi pplottjata l-kurva standard.
D. Denaturazzjoni ta' kampjuni ta' proteini għal WB
a. Saħħan il-banju tal-ilma minn qabel sal-punt tat-togħlija biex tevita t-togħlija niexfa u oqgħod attent għas-sigurtà.
b. Uża 5× protein loading buffer, li jinħażen f'-20°C, blu skur, u dewbu qabel l-użu.
c. F'kull grupp ta' kampjuni tas-supernatant tal-proteina, għandek tipprepara l-volum korrispondenti ta' buffer tat-tagħbija (supernatant tal-proteina: buffer = 4:1) separatament u tonfoħ sew.
d. Kull tubu tal-kampjun għandu jitwaħħal mal-klipp li ma jgħaddix ilma minnu, jiddaħħal fil-galleġġjant tal-isponża, jiġi denaturat b'ilma jagħli għal 5 minuti, imkessaħ b'ilma kiesaħ għal minuta, u ripetut tliet darbiet biex jiġi żgurat li l-kampjuni tal-proteini jkunu ġew denaturati kompletament.
e. Il-proteina denaturata għandha tkun blu b'mod uniformi, ċara, u trasparenti. Il-kampjun għandu jiġi ċċentrifugat ftit, maħżun f'temperatura ta' -20°C, u mwarrab.
f. Sa dan il-pass, dan l-esperiment huwa komplut.
Kif tixtri cell scrape & cell lifter?
Jekk inti interessat tagħna Barraxa taċ-ċelluli u Lifter taċ-ċelluli jew għandek xi mistoqsijiet, jekk jogħġbok ikteb e-mail lil info@antiteck.com, aħna nwieġbuk kemm jista 'jkun malajr.