Katalgu: Tagħmir Għall-Elisa Kit Manufacturing
ELISA, magħruf ukoll bħala assaġġ immunosorbent marbut ma 'l-enżimi, huwa metodu komuni għad-determinazzjoni kwantitattiva tal-kontenut ta' diversi proteini fil-mira fil-fluwidi tal-ġisem.
Ir-reazzjoni kolorimetrika tagħha tippermetti analiżi kwalitattiva jew kwantitattiva, bl-użu tat-TMB katalizzat bl-enżimi HRP, ir-reazzjoni tipproduċi soluzzjoni ta 'imine blu, u ż-żieda ta' soluzzjoni ta 'terminazzjoni tittrasforma l-katjoni blu f'biphenylquinone isfar.
Minbarra l-blu u l-isfar komuni, iseħħu xi kuluri mhux tas-soltu u diversi waqt esperimenti ELISA. Wara kull kulur, hemm tifsira speċjali. Sussegwentement, se nanalizzaw is-sigrieti tal-kulur moħbija fid-"dehra" u l-"output" ta 'ELISA.
Xi komponenti tal- Kit ELISA se jkollu kulur aħmar/roża minħabba ż-żieda ta 'aġenti protettivi speċjali, bħal ċerta serje ta' dilwizzjonijiet ta 'konjugat ta' enzima u kkonċentrati antikorpi bijotinilati. Ir-reaġenti ta 'dan il-kulur jaħdmu b'mod normali u għandhom jintużaw b'kunfidenza skont ir-rekwiżiti operattivi fl-istruzzjonijiet.
Fl-esperimenti ELISA, id-dilwent fih preservattivi u normalment huwa likwidu ċar, trasparenti u bla riħa. Jekk id-dilwent isir imdardar, jinxtamm, u jipproduċi preċipitazzjoni, l-odds huma li jkun ikkontaminat bil-batterja u mhux rakkomandat għal aktar użu.
In esperimenti ta' analiżi immunosorbenti marbuta ma' enżimi sottostrat TMB soluzzjonijiet mhux maħżuna 'l bogħod mid-dawl u li jitħallew miftuħa għal żmien twil wisq se jiġu ossidizzati mill-enzima HRP fl-arja u jidhru blu ċar/blu. L-użu dirett taħt ċirkostanzi bħal dawn iwassal għal riżultati pożittivi foloz. Għalhekk, mhuwiex rakkomandat li tkompli tuża soluzzjoni TMB li saret blu.
B'mod normali esperiment ELISA, ir-reazzjoni tintemm meta gradjent blu ċar jidher fl-ewwel erba 'bjar tal-markatur wara l-inkubazzjoni bis-soluzzjoni tas-sottostrat. Madankollu, meta l-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tax-xogħol tal-konjugat tal-enżima HRP inkubata tkun għolja wisq jew il-konċentrazzjoni tal-kampjun hija ħafna ogħla mill-firxa ta 'skoperta, l-ogħla 1-2 bjar gradjent jew bjar tal-kampjun tal-kurva standard jistgħu jidhru aħdar skur jew blu skur.
Wara li l-kampjun aħdar skur itemm ir-reazzjoni, il-valur OD moqri f'450 nm jista 'jkun inqas mill-attwali; il-kurva tal-kalibrazzjoni blu skur tkun qrib wisq tal-valur OD tal-gradjent biex titwaħħal biex tikseb kurva tal-kalibrazzjoni valida u tikkalkula b'mod preċiż il-konċentrazzjoni tal-kampjun.
Rakkomandazzjonijiet
1. Ikkontrolla b'mod strett it-temperatura u l-ħin tal-inkubazzjoni f'kull pass u pprepara s-soluzzjoni tax-xogħol tal-konjugat tal-enżima HRP skont l-istruzzjonijiet.
2. Matul il-fażi tal-iżvilupp tal-kulur, ikkontrolla l-ħin tal-iżvilupp tal-kulur bid-dehra ta 'gradjent blu distint fl-ewwel erba' bjar.
3. Kampjuni b'konċentrazzjoni għolja wisq jeħtieġ li jiġu dilwiti fil-medda ta 'skoperta tal-kit qabel id-determinazzjoni.
Raġunijiet possibbli għall-kulur isfar tar-riżultati tal-esperimenti ELISA
Il-metodu tal-kompetizzjoni ELISA jitħaddem skont il-metodu sandwich: iż-żewġ prinċipji huma differenti u l-passi tal-operazzjoni huma differenti, jekk jogħġbok agħti attenzjoni għad-distinzjoni.
Ħasil mhux xieraq: ħawwad il-pjanċa qrib wisq tal-barmil tal-iskart, li jirriżulta fi tixrid ta 'dahar likwidu; ħawwad il-pjanċa mhux niexfa, li jirriżulta f'residwu likwidu jew fluss fi bjar oħra; ħasil meta kull bir ma jkunx injettat biżżejjed soluzzjoni tal-ħasil, jew in-numru tal-ħasil mhux biżżejjed; wisq kontaminazzjoni tal-overflow likwidu; il-ħin tal-immersjoni huwa qasir wisq.
Ħażna mhux xierqa ta 'kromoġenu, jew inkubazzjoni mingħajr protezzjoni tad-dawl, li tirriżulta fi żvilupp ta' kulur mhux speċifiku.
It-temperatura ta 'inkubazzjoni hija għolja wisq, jew il-ħin ta' inkubazzjoni huwa twil wisq.
Taħlit jew sostituzzjoni ta 'komponenti ta' kit differenti, li jirriżultaw f'effett ta 'matriċi jew adsorbiment mhux speċifiku, li jwassal għal riżultati pożittivi foloz.
Wara li l-qari ġie kkalkulat, instab li t-twaħħil tal-kurva standard kien tajjeb, iżda l-OD tal-kampjun qabeż l-OD massimu tal-kurva standard, li jindika li l-kampjun xorta kien jeħtieġ li jiġi dilwit oh.
Wara li żżid is-soluzzjoni tat-terminazzjoni, il-likwidu fil-bjar tal-pjanċa ELISA isir iswed, jew tiġi prodotta preċipitazzjoni sewda
Kawżi possibbli
Il-konċentrazzjoni tal-enżima HRP hija għolja wisq: meta tħejji s-soluzzjoni tax-xogħol tal-enzima HRP, żgura li l-kalkolu u l-volum tal-preparazzjoni huma preċiżi, u aħsel il-pjanċa skont il-volum tal-ħasil, il-ħin u n-numru ta 'drabi fl-istruzzjonijiet.
Il-konċentrazzjoni tal-indikatur fil-kampjun hija għolja wisq u l-kampjun għad irid jiġi dilwit.
Il-konċentrazzjoni ta 'aċidu sulfuriku fis-soluzzjoni tat-terminazzjoni hija għolja wisq jew maħmuġ: is-soluzzjoni tat-terminazzjoni hija 1M H2SO4, it-taħlit ma' konċentrazzjoni għolja wisq ta 'aċidu sulfuriku jista' jwassal għal reazzjoni ta 'charring.