ANTITECK - Ipprovdi Tagħmir tal-Lab, Awtomazzjoni Industrijali, Moulding Mediku u Soluzzjoni Turnkey.
tagħmir-bijoloġija-laboratorju

Kif tagħmel Elisa Test?

Posted fuq Ottubru 23, 2022 by Zeng YingELISA

Proċeduri sperimentali ELISA

il proċedura ELISA jista 'jinqasam bejn wieħed u ieħor fi tliet proċessi. Dawn huma d-disinn tal-protokoll ELISA, l-interpretazzjoni tad-dejta inizjali tal-ELISA, u l-kalkolu tar-riżultati tal-ELISA.

Katalgu: Tagħmir-Għal-Elisa-Kit-Manifattura

Elisa kisi amchine, magna tal-washer elisa

Disinn ta' protokoll sperimentali ta' ELISA

A maħsub sew u perfett ELISA Id-disinn tal-protokoll sperimentali jeħtieġ l-arranġament razzjonali ta 'diversi fatturi sperimentali u kontroll strett ta' żbalji sperimentali, u b'hekk jiġi evitat il-ħela ta 'riżorsi umani, materjali u finanzjarji kkawżati minn esperimenti li jmexxu bl-addoċċ.
Normalment, nirrakkomandaw li l-ewwel żewġ kolonni tal-pjanċa tal-mikrotiter 96 użata għal esperimenti ELISA jiġu stabbiliti bħala bjar ta 'spotting standard, filwaqt li jiġu stabbiliti 8 konċentrazzjonijiet gradjent, 2 kolonni ta' bjar komposti, u żżid is-soluzzjoni standard tax-xogħol minn konċentrazzjonijiet baxxi għal għoljin , b'mod sekwenzjali mill-qiegħ sal-quċċata tal-pjanċa standard tal-enzima.
L-aħħar 10 kolonni tal-pjanċa tal-mikrotiter jistgħu jiġu stabbiliti bħala l-bjar tal-kampjuni għall-kampjuni li jridu jiġu ttestjati, u ġeneralment iwaqqfu 2 bjar duplikati. Skont ir-rekwiżiti sperimentali, jistgħu jiġu stabbiliti grupp normali, grupp mudell, grupp ta 'trattament, eċċ.

ELISA
ELISA

Interpretazzjoni tad-dejta inizjali tal-ELISA

preċiżjoni: Il-preċiżjoni ta' an Assaġġ immunosorbenti marbut ma' enzimi jirrifletti r-riproduċibbiltà tad-dejta mkejla. Il-preċiżjoni hija ġeneralment espressa mill-koeffiċjent tal-varjazzjoni CV (CV = devjazzjoni standard / medja × 100%). B'mod ġenerali, is-CV kemm tal-istandard kif ukoll tal-kampjun OD għandhom ikunu ≤ 10%.

esperiment-assay-immunosorbent-linked-enżimi
esperiment-assay-immunosorbent-linked-enżimi

Valur OD: Il-valur OD tal-bir vojt ta ELISA huwa ≤ 0.1 (metodu sandwich). L-OD massimu tal-istandard huwa ≥1.2. L-OD tal-kampjun għandu jaqa' fil-medda tal-kurva standard.

Firxa lineari: R2 ≥ 0.99 għal koeffiċjent ta 'korrelazzjoni ta' rigressjoni lineari tal-kurva standard.

Assaġġ immunosorbenti marbut ma' enzimi
Assaġġ immunosorbenti marbut ma' enzimi

Kalkolu tar-riżultat tal-esperiment ELISA

Bħala l-aħħar pass tal- esperiment ELISA, il-kalkolu tar-riżultati tal-assaġġ huwa importanti ħafna għall-esperiment kollu.

Nieħdu l-metodu sandwich bħala eżempju biex nintroduċu l-kalkolu tar-riżultat tal-esperiment ELISA.

Kampjuni ta 'ELISA normalment ikollhom jistabbilixxu 1 ~ 2 bjar duplikati għall-ittestjar, u l-valur medju ta' assorbiment ta 'standards u kampjuni tal-grupp sperimentali huma derivati ​​rispettivament. Il-valur ta' skoperta ta' kampjun wieħed m'għandux jaqbeż l-20% tal-valur medju.

Il-valur medju ta 'OD (assorbenza) ta' kampjuni ELISA għandu jitnaqqas mill-valur medju ta 'OD meta l-konċentrazzjoni ta' standard hija 0.

Stabbilixxi l-kurva standard: waħħal kurva tal-funzjoni loġistika ta 'erba' parametri fuq plot ta 'koordinati logaritmiċi (konċentrazzjoni standard fuq l-assi X u l-valur OD korrispondenti fuq l-assi Y). Irrakkomanda li tuża softwer tal-oriġini.

Passi dettaljati tal-esperiment ELISA

Pass 1: Daħħal il-konċentrazzjoni standard u l-valur OD

proċedura ELISA
proċedura ELISA

Pass 2: Agħżel it-tip ta 'kurva li trid titwaħħal - twaħħil ta' kurva mhux lineari

ELISA-kontroll pożittiv
ELISA-kontroll pożittiv

Pass 3: Agħżel Statistika u Loġistika, iċċekkja "Sib X minn Y"

ELISA-kontroll negattiv
ELISA-kontroll negattiv

Pass 4: Ara l-informazzjoni tal-kurva standard tal-ELISA (eż. valuri tal-parametri, R-Square, eċċ.)

prinċipju ELISA
prinċipju ELISA

Pass 5: Immodifika t-titlu tal-koordinati orizzontali u vertikali u ssettja t-tip tal-assi għal logaritmiku

Ikklikkja darbtejn fuq il-grafika ta' l-ELISA fit-4 pass u editjaha. Ikklikkja darbtejn it-titlu tal-koordinati orizzontali u vertikali modifikati, ikklikkja darbtejn fuq l-assi X u l-assi Y, issettja t-tip ta 'koordinati għal "Log10", u ssettja l-firxa tal-koordinati orizzontali u vertikali.

ELISA-esperiment
ELISA-esperiment

Pass 6: Ikkalkula l-konċentrazzjoni tal-kampjun mill-kurva standard

Agħżel ir-raba 'worksheet (Fit NL Find X from Y1), daħħal il-valur OD tal-kampjun fil-kolonna tax-xellug, u l-konċentrazzjoni korrispondenti tiġi ġġenerata awtomatikament fil-kolonna tal-lemin.

dejta ELISA
dejta ELISA

Punti tal-ħakma tal-esperiment ELISA

Mill-inqas il-punti li ġejjin għandhom jiġu mhaddma meta jsiru esperimenti ELISA.

test ELISA
test ELISA

Kif tagħżel kontroll pożittiv ELISA adattat?

Il-kompożizzjoni bażika tal- assaġġ immunosorbenti marbut ma' enzimi kontroll pożittiv għandu jkun l-istess bħal dak tal-kampjun tal-assaġġ sa fejn hu possibbli. Ġeneralment, kontrolli pożittivi huma l-aktar ibbażati fuq buffer li jkun fih protettur tal-proteini u li jżid ċertu ammont tas-sustanza li trid tiġi ttestjata. Pereżempju, għad-determinazzjoni tas-serum uman bħala l-kampjun, il-kontroll pożittiv huwa l-aktar magħmul mid-determinazzjoni tas-serum tal-pazjent jew tal-plażma umana tal-kalċju kompost b'ċertu ammont ta 'standard.

Kif tagħżel kontroll ELISA negattiv adattat?

Il-kompożizzjoni bażika tal- Kontroll negattiv ELISA għandu jkun konsistenti wkoll mal-kompożizzjoni tal-kampjun tat-test kemm jista 'jkun, u l-aħjar huwa li l-ewwel jiġi ttestjat biex jiġi ddeterminat li ma fihx is-sustanza li trid tiġi ttestjata. Pereżempju, meta jiġu ttestjati kampjuni tas-serum uman, il-kontroll negattiv għandu jkun serum uman normali; meta tiġi ttestjata l-qawwa tal-antikorpi fis-serum ta 'annimali immuni, il-kontroll negattiv għandu jkun is-serum pre-immuni tal-annimal.

Kif tagħżel l-aħjar kundizzjonijiet tal-kisi fl-esperimenti ELISA?

Għażla ta' antiġeni inkapsulati

Antiġeni inkapsulati jistgħu jinqasmu fi tliet kategoriji: proteini naturali, proteini rikombinanti, u antiġeni ta 'molekula żgħira. Proteini naturali jeħtieġ li jiġu ppurifikati biex jiġu miksija bil-metodu ta 'assorbiment dirett, għal antiġeni li fihom aktar impuritajiet jistgħu jiġu miksija b'metodu ta' qbid indirett (sustanzi għall-ewwel użu li jistgħu jirreaġixxu ma 'l-antiġen fil-mira bħal antikorpi adsorbiti direttament fuq il-pjanċa standard ta' l-enżima, u imbagħad agħmel il-fażi solida tal-antiġen b'reazzjoni speċifika). Proteini rikombinanti purifikati jistgħu ġeneralment ikunu miksija direttament. Antiġeni ta 'molekula żgħira bħal peptidi u xi komposti organiċi ta' molekula żgħira ħafna drabi huma diffiċli biex jassorbu direttament fuq il-pjanċa tal-enżima minħabba l-piż molekulari żgħir tagħhom u ġeneralment huma akkoppjati ma 'proteini mhux relatati bħal BSA, u l-koppji huma adsorbiti fuq it-trasportatur tal-fażi solida.

Għażla tas-soluzzjoni tal-kisi

Is-soluzzjoni tal-kisi tal-ELISA hija ġeneralment buffer tal-karbonat pH 9.6, jew buffer tal-fosfat pH 7.2 jekk l-antiġenu ma jkunx stabbli taħt kundizzjonijiet alkalini.

Għażla tat-temperatura tal-kisi ELISA

It-temperatura tal-kisi ELISA hija ġeneralment 4-8 gradi Celsius matul il-lejl jew 37 grad Celsius għal 2 sigħat, nirrakkomandaw bil-qawwa 4-8 gradi Celsius għaż-żamma tal-attività tal-proteina.

Għażla tal-konċentrazzjoni tal-kisi ELISA

L-aħjar konċentrazzjoni tal-kisi ELISA tvarja man-natura tat-trasportatur tal-fażi solida u l-kisi, ġeneralment, il-konċentrazzjoni tal-kisi tal-proteina hija 1-5ug/ml, biex tispeċifika l-aqwa konċentrazzjoni tal-kisi għal antiġen tal-kisi speċifiku jeħtieġ li jiġi determinat b'esperiment.

Għandi bżonn nissiġilla l-bord wara li ngeżwer? X'tip ta' sistema ta' għeluq għandha tintgħażel fl-esperimenti ELISA?

Jekk l-għeluq huwiex meħtieġ jiddependi fuq il-mod ta' ELISA u l-kundizzjonijiet esperimentali speċifiċi. B'mod ġenerali, għall-assaġġ sandwich ta 'antikorpi doppji, sakemm il-markatur tal-enzima jkun attiv ħafna u l-operazzjoni tinħasel sewwa, jistgħu jinkisbu riżultati sodisfaċenti mingħajr għeluq. B'kuntrast, f'assaġġi indiretti, it-trażżin huwa ġeneralment essenzjali.

Is-siġillanti komunement użati huma 0.05% -0.5% BSA, 10% serum tal-għoġol, 1% ġelatina, u 5% trab tal-ħalib xkumat, AbMART jirrakkomanda li tuża 5% trab tal-ħalib xkumat, li huwa rħas u għandu l-kapaċità qawwija ta 'siġillar, madankollu, 5 % trab tal-ħalib xkumat huwa adattat biss għal użu għal żmien qasir u m'għandux jinħażen għal żmien twil, għalhekk huwa inqas użat fil-kit.

Kif tuża l-konjugati tal-enzimi korretti fl-esperimenti ELISA?

Dilwizzjonijiet ta' konjugati ta' enżimi

Konċentrazzjonijiet għoljin ta 'proteini estranji (eż. 1% BSA jew 5% trab tal-ħalib xkumat) huma spiss miżjuda mad-dilwent biex jinibixxu l-assorbiment mhux speċifiku ta' konjugati ta 'enżimi fuq it-trasportatur tal-fażi solida permezz tal-kompetizzjoni. Surfactant mhux ijoniku kapaċi jinibixxi l-assorbiment tal-proteini fuq il-wiċċ tal-plastik, bħal Tween 20 (il-konċentrazzjoni ta '0.05% hija ppreferuta), huwa wkoll ġeneralment miżjud.

Dilwizzjoni xierqa tal-konjugati tal-enżimi

Il-konċentrazzjoni xierqa tax-xogħol tal-konjugat tal-enżima jeħtieġ li tiġi determinata minn esperimenti minn qabel. Konċentrazzjoni għolja wisq għandha t-tendenza li twassal għal sfond għoli, filwaqt li konċentrazzjoni baxxa wisq twassal għal tiddgħajjef tas-sinjal pożittiv.

Il-konjugat ta 'l-enżima għandu preferibbilment jiġi dilwit qabel l-użu, u l-konjugat ta' l-enżima dilwit m'għandux jinħażen għal żmien twil, peress li konċentrazzjonijiet baxxi tal-konjugat ta 'l-enżima huma suxxettibbli ħafna għall-inattivazzjoni.

MistoqsijaKawżi possibbliSoluzzjoni
Kontrolli negattivi taw riżultati pożittivi1. Kontaminazzjoni ta 'reaġenti jew konsumabbli
2. Problemi bil-ħasil tal-pjanċa
3. Jekk il-problema sseħħ fil-metodu sandwich ta 'antikorp doppju, huwa possibbli li jkun hemm reazzjoni inkroċjata bejn l-antikorp tal-kisi u l-antikorp sekondarju.
4. Użu ta 'wisq antikorpi
1. Reaġenti li jinbidlu, bl-użu ta 'provvisti li jintremew
2. Ibdel is-soluzzjoni tal-ħasil b'formula aktar b'saħħitha, żid in-numru ta 'ħasil tal-pjanċa u estendi l-ħin tal-ħasil tal-pjanċa.
3. Sostituzzjoni ta 'antikorp miksi jew antikorp sekondarju
4. Naqqas l-ammont ta 'antikorpi użati.
Il-bord kollu jidher sfond għoli1. Antikorp sekondarju jipproduċi adsorbiment mhux speċifiku
2. Is-soluzzjoni kromoġenika mhix friska
3. Ir-reazzjoni tal-iżvilupp tal-kulur ma tiġix mitmuma għal żmien twil wisq
4. Kontaminazzjoni ta 'reaġenti jew konsumabbli
5. Adsorbiment mhux speċifiku minħabba temperatura ta 'reazzjoni għolja
Adsorbiment mhux speċifiku minħabba kundizzjonijiet ħżiena ta 'konteniment
1. Naqqas l-ammont ta 'antikorp sekondarju użat, tqassar il-ħin ta' reazzjoni ta 'antikorp sekondarju
2. Uża soluzzjoni ta 'żvilupp tal-kulur lesta
3. Ikkontrolla l-ħin ta 'reazzjoni tal-iżvilupp tal-kulur, u ttemm ir-reazzjoni fil-ħin
4. Ibdel ir-reaġenti u uża konsumabbli li jintremew
5. Ikkontrolla b'mod strett ir-reazzjoni fl-aħjar temperatura
6. Ibdel is-soluzzjoni tal-imblukkar b'soluzzjoni tal-imblukkar aktar qawwija u estendi l-ħin tal-imblukkar
Sinjal ta 'reazzjoni baxx1. Kundizzjonijiet mhux xierqa tal-kisi
2 .Reazzjoni inadegwata ta 'antiġen u antikorp
3. Formulazzjoni mhux xierqa ta 'soluzzjoni għall-iżvilupp tal-kulur
4. Twaħħil sekondarju insuffiċjenti ta 'antikorpi
1. Żid il-konċentrazzjoni tal-pjanċa, estendi l-ħin tal-pjanċa
2. Estendi l-ħin tar-reazzjoni biex tiżgura li r-reazzjoni titwettaq fl-aħjar temperatura u żżid l-ammont ta 'sottostrat kromoġeniku
3. Żid il-konċentrazzjoni ta 'antikorp sekondarju, testendi l-ħin ta' reazzjoni, u ibdel l-antikorp sekondarju b'wieħed aktar effettiv.
Dilwizzjoni tal-gradjent biex tagħmel ELISA tipproduċi fenomenu ta 'toqba jaqbeż1. Trasferiment irregolari tas-sħana minħabba stivar ta 'pjanċi ta' l-enżimi, differenzi fit-temperatura ta 'reazzjoni ta' kull bir
2. Id-dilwizzjoni tal-pipetta ma żżommx kontinwità
3. Evaporazzjoni tas-soluzzjoni tar-reazzjoni
4. Ħasil ​​irregolari tal-pjanċa
5. Hemm debris jew qtar ta 'ilma fuq il-qiegħ tal-pjanċa ta' l-enżimi
1. Evita li tistiva l-pjanċi flimkien kemm jista 'jkun
2. Ikkalibra l-pipetta regolarment biex tiżgura l-użu xieraq tal-pipetta
3. Issiġilla jew ikopri l-pjanċi b'siġill
4. Kun żgur li l-washer tal-pjanċa qed taħdem sew u naddaf il-pjanċi meta taqra
Elisa Microplate Washer + Kisi + Imblukkar 3 Funzjoni F'Magna Waħda Għall-Kit ta 'Elisa Skala Kbira
Aħna nużaw cookies sabiex jagħtuk l-aħjar esperjenza possibbli fuq il-websajt tagħna. Billi tkompli tuża dan is-sit, taqbel mal-użu tagħna tal-cookies.
Aċċetta
Regoli tal-privatezza