Midja tal-Ffriżar taċ-Ċelloli
X'inhu l-midja tal-iffriżar taċ-ċelluli?
Il-krijopreservazzjoni taċ-ċelluli hija metodu komuni tat-teknoloġija tal-kultura taċ-ċelluli għall-preservazzjoni u l-ħażna fit-tul taċ-ċelloli. Medja għall-iffriżar taċ-ċelluli, soluzzjoni li trid tintuża għaċ-ċelluli lajofilizzazzjoni, jintuża għall-preservazzjoni taċ-ċelloli u għandu rwol ewlieni fix-xiri, id-dispaċċ, l-iskambju, u l-kunsinna taċ-ċelloli. Għalhekk, huwa speċjalment importanti li tagħżel wieħed tajjeb mezz għall-iffriżar tal-kultura taċ-ċelluli.
Mezz tal-iffriżar tal-kultura taċ-ċelluli
Ir-riċerkaturi spiss ikollhom bżonn iffriżar ċelluli u jippreservahom għal esperimenti sussegwenti jew użu kliniku. Il-proċess bażiku huwa pjuttost sempliċi: iffriża ċ-ċelloli bil-mod, poġġi t-tubi tal-krijopreservazzjoni fin-nitroġenu likwidu, u ħollhom malajr meta jkun meħtieġ. Medja għall-iffriżar taċ-ċelluli jappoġġja ċ-ċelloli u jipprevjeni l-iffurmar tal-kristalli tas-silġ. Madankollu, ir-riżultati ta 'użu differenti midja iffriżar jistgħu jkunu differenti ħafna.
Il-midja konvenzjonali tal-iffriżar taċ-ċelluli żżid aġent protettiv mal-mezz tal-kultura, li tipikament huwa 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) u 10% -90% serum bovin. Il-problemi li jiltaqgħu magħhom meta ċelluli iffriżar fil konvenzjonali soluzzjoni ta' lijofilizzazzjoni taċ-ċelluli huma miġbura fil-qosor kif ġej.
a. Tkessiħ proċedurali (4°C → -20°C → -80°C → nitroġenu likwidu). Dan il-pass huwa tedjanti u jieħu ħafna ħin.
b. Li fihom serum b'riskju ogħla ta' kontaminazzjoni taċ-ċelluli (vajrusis, mikobatterji, mikoplażma, eċċ.).
c. Id-differenzi fil-lott tas-serum u l-kwalità jwasslu għal differenzi fil-lottijiet tal-mezzi tal-iffriżar taċ-ċelloli.
d. L-iffriżar tan-nitroġenu likwidu huwa meħtieġ għal rekwiżiti għoljin ta' ffriżar.
e. Mikrovolum u in situ (eż., pjanċi tal-bjar) ma jistgħux jiġu lijofilizzati.
It-tliet prodotti ta ' lajofilizzazzjoni taċ-ċelluli mingħajr serum li ġejjin huma kollha tkessiħ mingħajr serum u mhux ipprogrammat u jistgħu jitqiegħdu direttament fil-friġġ -80 ° C għal iffriżar u ħażna fit-tul.
A. Soluzzjoni ta' liofilizzazzjoni taċ-ċelluli mingħajr serum
Il-karatteristika tal-prodott
a. Ħieles mis-serum u l-proteini derivati mill-annimali biex titnaqqas il-kontaminazzjoni minn viruses, mikobatterji, u mikoplażma.
b. Formula speċjali tista' ttejjeb b'mod effettiv ir-rata ta' sopravivenza tal-iffriżar taċ-ċelloli u r-rata ta' rkupru.
c. Lest għall-użu, l-ebda preparazzjoni fuq il-post meħtieġa.
d. Tip universali, li huwa adattat għall-iffriżar u l-ħażna ta' diversi linji ta' ċelluli tal-annimali u tal-bniedem u ċelluli primarji.
e. Kompożizzjoni ċara, l-ebda varjazzjoni minn lott għal lott.
f. L-ebda tkessiħ ipprogrammat u l-ebda nitroġenu likwidu mhu meħtieġ. Jista' jitqiegħed direttament f'-80℃ għal iffriżar u ħażna fit-tul.
g. L-iffriżar mikro u in situ (eż. l-iffriżar taċ-ċelluli tal-ibridoma) huwa possibbli, u b'hekk jiffranka l-ħin u l-effiċjenza.
Effett tal-iffriżar
| Linja taċ-ċelluli | Ħin tal-iffriżar / (Xahar) | Rata ta' sopravivenza taċ-ċelluli (%) / (Temperatura tal-iffriżar -80℃) |
|---|---|---|
| 293T | 12 | 95.58 |
| 4T1 | 12 | 96.25 |
| HUVEC | 12 | 88.14 |
| Hela | 12 | 93.18 |
B. Mezz ta' krijopreservazzjoni taċ-ċelluli b'DMSO baxx mingħajr serum
Il-karatteristika tal-prodott
a. Sigurtà għolja, mingħajr serum, u ingredjenti derivati mill-annimali, possibbiltà baxxa ta' kontaminazzjoni minn viruses, mikobatterji, u mikoplażma. Konsistenza ogħla fil-kwalità tal-prodott minn lott għal lott.
b. DMSO baxx b'5% DMSO (v/v), li jnaqqas ħafna l-effetti tossiċi potenzjali fuq iċ-ċelloli.
c. Vijabbiltà għolja taċ-ċelluli mingħajr differenzi fil-lott.
d. Formulazzjoni likwida kompletament lijofilizzata, lesta għall-użu dirett, konvenjenti u sempliċi. Tista' tinħażen direttament fi friġġ ta' -80℃ għall-iffriżar u l-ħażna mingħajr ma tgħaddi mill-proċess li jieħu ħafna ħin ta' tkessiħ programmat (tiffranka ħin, sforz u flus).
e. Jista' jiġi ffriżat in situ, bħal subkloni ta' ċelloli ibridomi, li jistgħu jnaqqsu bil-kbir l-ammont ta' xogħol u jevitaw il-kontaminazzjoni.
Effett tal-iffriżar
| Linja taċ-ċelluli | Ħin tal-iffriżar / (Xahar) | Tqabbil A Rata ta' sopravivenza taċ-ċelluli (%) | Tqabbil B Rata ta' sopravivenza taċ-ċelluli (%) | Rata ta' sopravivenza taċ-ċelluli (%) |
|---|---|---|---|---|
| 3T3 | 1 | 86 | 89 | 97 |
| 293E | 1 | 85 | 86 | 93 |
| 293F | 1 | 85 | 85 | 92 |
C. Mezz ta' krijopreservazzjoni taċ-ċelluli mingħajr serum u mingħajr DMSO
Il-karatteristika tal-prodott
a. Sigurtà għolja, mingħajr serum, u ingredjenti derivati mill-annimali, possibbiltà baxxa ta' kontaminazzjoni minn viruses, mikobatterji, u mikoplażma. Konsistenza ogħla fil-kwalità tal-prodott minn lott għal lott.
b. Bla DMSO, l-ebda effetti tossiċi potenzjali fuq iċ-ċelloli.
c. Vijabbiltà għolja taċ-ċelluli mingħajr differenzi fil-lott.
d. Formulazzjoni kompluta ta' soluzzjoni ta' liofilizzazzjoni, tista' tintuża direttament, konvenjenti u sempliċi.
e. Jista' jinħażen direttament fi friġġ ta' -80℃ għall-iffriżar, mingħajr ma jgħaddi mill-proċedura li tieħu ħafna ħin tat-tkessiħ (jiffranka l-ħin, l-isforz u l-flus). M'hemmx bżonn li tuża strument tat-tkessiħ ipprogrammat, u m'hemmx bżonn li jitqiegħed f'nitroġenu likwidu ta' -196℃.
f. Jista' jiġi ffriżat in situ, bħal subkloni ta' ċelloli ibridomi, li jistgħu jnaqqsu bil-kbir l-ammont ta' xogħol u jevitaw il-kontaminazzjoni.
Tqabbil tal-midja universali tal-iffriżar taċ-ċelluli mat-tliet mezzi tal-iffriżar taċ-ċelluli mingħajr serum ta 'hawn fuq
| Medju universali għall-iffriżar taċ-ċelluli | Soluzzjoni ta' lajofilizzazzjoni taċ-ċelluli mingħajr serum | Medju krijopreservazzjoni taċ-ċelluli DMSO baxx mingħajr serum | Medju ta' krijopreservazzjoni taċ-ċelluli mingħajr serum mingħajr DMSO | |
|---|---|---|---|---|
| Komponenti ewlenin | Li jkun fih serum, DMSO | Ħieles serum, b'DMSO 10% | Ħieles serum, b'DMSO 5% | Mingħajr serum u mingħajr DMSO |
| Ċitotossiċità | Għoli | Għoli | Baxxa | - |
| Sigurtà | Baxxa Riskju għoli ta 'kontaminazzjoni b'viruses, mikobatterji, u mikoplażma ta' oriġini mill-annimali | Għoli L-ebda riskju ta 'kontaminazzjoni b'viruses, forom, u mikoplażma ta' oriġini mill-annimali | Għoli L-ebda riskju ta 'kontaminazzjoni b'viruses, forom, u mikoplażma ta' oriġini mill-annimali | Għoli L-ebda riskju ta 'kontaminazzjoni b'viruses, forom, u mikoplażma ta' oriġini mill-annimali |
| Tipi ta' ċelluli krijopreservati | Adattat għall-iffriżar taċ-ċelloli li fihom is-serum | Użu ġenerali Adattat għat-tipi kollha ta 'krijopreservazzjoni taċ-ċelluli | Użu ġenerali Adattat għat-tipi kollha ta 'krijopreservazzjoni taċ-ċelluli | Użu ġenerali Adattat għat-tipi kollha ta 'krijopreservazzjoni taċ-ċelluli |
| Stat tat-tkabbir taċ-ċelluli tal-kultura mingħajr serum | Faċli biex tinbidel, faċli biex tirritorna mill-istat sospiż għall-istat b'ħitan | Żomm l-istatus tal-kultura tas-sospensjoni | Żomm l-istatus tal-kultura tas-sospensjoni | Żomm l-istatus tal-kultura tas-sospensjoni |
| Differenzi fil-lott | Differenzi kbar fil-lottijiet | Ebda differenzi fil-lott | Ebda differenzi fil-lott | Ebda differenzi fil-lott |
| Metodu ta 'operazzjoni | Passi ineffiċjenti, li jeħtieġu tkessiħ u ffriżar programmati | Faċli u veloċi Pass wieħed iffriżar -80℃ friġġ | Faċli u veloċi Pass wieħed iffriżar -80℃ friġġ | Faċli u veloċi Pass wieħed iffriżar -80℃ friġġ |
| Tagħmir ta' Preservazzjoni | Rekwiżit għoli (nitroġenu likwidu) | Rekwiżit baxx (friġġ -80℃) | Rekwiżit baxx (friġġ -80℃) | Rekwiżit baxx (friġġ -80℃) |
| Mikro-iffriżar | Mewt taċ-ċelluli faċli u rata ta 'sopravivenza baxxa | Rata għolja ta 'sopravivenza taċ-ċelluli | Rata għolja ta 'sopravivenza taċ-ċelluli | Rata għolja ta 'sopravivenza taċ-ċelluli |
| Iffriżar fil-post | Mhux fattibbli | Vijabbli u faċli biex tużah | Vijabbli u faċli biex tużah | Vijabbli u faċli biex tużah |
Użu ta' midja għall-iffriżar taċ-ċelluli
Medju ta' ffriżar tal-kultura taċ-ċelluli ta' rkupru
Il-prinċipju bażiku tal-iffriżar u l-irkupru taċ-ċelluli huwa l-iffriżar bil-mod u t-tidwib mgħaġġel. L-esperimenti wrew li dan jista’ jimmassimizza l-preservazzjoni tal-vijabbiltà taċ-ċelluli.
Bħalissa, iffriżar taċ-ċelluli juża glycerol jew dimethyl sulfoxide bħala aġent protettiv. Dawn iż-żewġ sustanzi jistgħu jtejbu l-permeabilità tal-membrana taċ-ċellula għall-ilma, flimkien ma 'l-iffriżar bil-mod jista' jagħmel l-ilma ġewwa ċ-ċellula joħroġ miċ-ċellula, tnaqqas il-formazzjoni ta 'kristalli tas-silġ intraċellulari, u b'hekk tnaqqas il-ħsara taċ-ċelluli kkawżata mill-formazzjoni tas-silġ. kristalli. Ir-risuxxitazzjoni taċ-ċelloli għandha ssir permezz ta 'tidwib rapidu, li jista' jiżgura li l-kristalli extraċellulari jiddewweb fi żmien qasir ħafna u tevita ħsara liċ-ċelloli minħabba tidwib bil-mod li jippermetti li l-ilma jidħol fiċ-ċelloli biex jiffurmaw rikristallizzazzjoni intraċellulari.
Il-krijopreservazzjoni taċ-ċelluli hija għodda teknika importanti għall-kultura taċ-ċelluli, l-introduzzjoni taż-żerriegħa, il-preservazzjoni taż-żerriegħa u l-esperimentazzjoni bla xkiel. Huwa importanti li ċ-ċelloli primarji jiġu ffriżati fil-pront fil-kultura taċ-ċelluli u l-istabbiliment tan-nisel. Fil-proċess ta 'preparazzjoni ta' antikorpi monoklonali ta 'hybridoma, l-iffriżar u l-preservazzjoni taż-żerriegħa taċ-ċelloli ta' l-ibridoma, ċelluli subklonali miksuba minn kull klonazzjoni ħafna drabi hija operazzjoni sperimentali essenzjali. Mingħajr l-istabbiliment ta 'linja ta' ċelluli stabbli jew linja ta 'ċelluli stabbli li tnixxi l-antikorpi, il-proċess tal-kultura taċ-ċelluli jista' jfalli fi kwalunkwe ħin minħabba l-kontaminazzjoni taċ-ċelluli, telf ta 'kapaċità ta' sekrezzjoni ta 'antikorpi jew mutazzjoni ġenetika, eċċ. Mingħajr l-iffriżar tal-oriġinal ċelluli, l-esperiment se jintilef minħabba l-inċidenti msemmija hawn fuq.
A. X'inhu l-iffriżar taċ-ċelloli?
Meta ċ-ċelloli jikbru sew u l-provvista taqbeż id-domanda, iċ-ċelloli jistgħu jitqiesu li huma ffriżati u maħżuna għal użu aktar tard. Meta t-temperatura tkun taħt -70 ℃, l-attività enżimatika ġewwa ċ-ċellula tieqaf u l-attività metabolika tieqaf, għalhekk l-iskop tal-ħażna fit-tul jista 'jinkiseb. Meta ċ-ċelloli tal-iffriżar, hekk kif tonqos it-temperatura, l-ilma ġewwa u barra ċ-ċelloli se jikkristallizza, u l-kristalli tas-silġ iffurmati jikkawżaw il-qerda tal-membrani taċ-ċelluli u l-organelli, u b'hekk jikkawżaw mewt taċ-ċelluli, speċjalment fl-istadju ta '-20-0 ℃, il-kristalli tas-silġ huma bħal labra u faċli biex jikkawżaw ħsara fiċ-ċelluli.
B. Kif tista' titnaqqas din il-ħsara intraċellulari mill-kristalli tas-silġ?
użu midja għall-iffriżar taċ-ċelluli. Il-komuni mezz għall-iffriżar tal-kultura taċ-ċelluli huwa glycerol jew dimethyl sulfoxide (DMSO), li jista 'jippenetra malajr il-membrana taċ-ċellula biex jidħol fiċ-ċellula, ibaxxi l-punt tal-iffriżar, idewwem il-proċess ta' lajofilizzazzjoni, u jżid il-permeabilità tal-membrana taċ-ċellula, iżżid il-konċentrazzjoni ta 'joni intraċellulari, tnaqqas il-formazzjoni ta 'kristalli tas-silġ intraċellulari, u b'hekk jintlaħaq l-iskop tal-protezzjoni taċ-ċelluli.
C. Tħejjija taċ-ċelloli għall-krijopreservazzjoni
Preparazzjoni ta 'soluzzjoni ta' lajofilizzazzjoni (ġeneralment 10% DMSO + 90% FBS b'mezz ta 'kultura). Or mezz għall-iffriżar taċ-ċelluli: serum: DMSO=7:2:1.
D. Operazzjoni ta' krijopreservazzjoni
Agħżel ċelluli b'vijabbiltà tajba u densità ta 'madwar 80%, meta ċ-ċelloli jkunu fil-fażi ta' tkabbir logaritmiku u huma l-aktar adattati għal-lijofilizzazzjoni. Il-liofilizzazzjoni taċ-ċelluli għadha maqsuma f'lijofilizzazzjoni taċ-ċelluli tal-ħajt u lajofilizzazzjoni taċ-ċelluli tas-sospensjoni.
Osserva l-istatus taċ-ċelluli taħt il-mikroskopju. Jekk id-densità taċ-ċelluli kienet għolja u l-mezz sar isfar, kien meħtieġ li l-likwidu jinbidel għal 4 sigħat qabel l-operazzjoni tal-liofilizzazzjoni. Wara li ċ-ċelluli jkunu kibru għalkollox, il-mezz fid-dixx tal-kultura ġie aspirat bir-reqqa b'pistola, u mbagħad il-PBS ġie laħlaħ darba jew darbtejn, u pprova aspira l-PBS maħsul, u t-tripsina ġew miżjuda biex jiddiġerixxu ċ-ċelluli. Id-diġestjoni trid tagħti attenzjoni lill-kontroll tal-ħin tal-azzjoni tat-tripsina, id-diġestjoni taċ-ċelluli minħabba li kull ċellula teħel mal-ħajt hija differenti, u l-ħin tad-diġestjoni jvarja ħafna. Id-diġestjoni tat-tripsina hija operazzjoni delikata, mhux biss biex tiddiġerixxi kompletament iċ-ċelluli u tkisserhom f'sospensjoni ta' ċellula waħda għal inokulazzjoni uniformi iżda wkoll biex tevita ħsara severa liċ-ċelluli kkawżata minn diġestjoni eċċessiva. L-attività tat-tripsina, il-passi tad-diġestjoni, u r-reaġenti użati minn kull klijent huma differenti, għalhekk il-ħin tad-diġestjoni ma jistax jiġi speċifikat għalkollox, u l-esperjenza tal-klijent tipprevali. Għall-pass tad-diġestjoni, jekk il-klijent għandu ftit esperjenza biċ-ċellula u ma jistax jikkontrolla b'mod preċiż il-ħin tal-azzjoni tat-tripsina, nissuġġerixxu li l-klijent isegwi l-operazzjoni li ġejja: l-ewwel, żid iċ-ċellula wara li t-tripsina terġa' tissaħħan għat-temperatura tal-kamra, poġġiha f'temperatura ta' 37℃ inkubatur, u mbagħad nefaħ iċ-ċellula kull 30 sekonda, jekk iċ-ċellula tista' tinfaħ tifred (mhux diġerita sakemm iċ-ċellula tkun f'wiċċ l-ilma kompletament), ifisser li d-diġestjoni taċ-ċellula tlestiet u d-diġestjoni tista' titwaqqaf. Wara d-diġestjoni taċ-ċellula, ħallat iċ-ċelloli bil-mod kemm jista' jkun biex ma tipproduċix wisq bżieżaq. Jekk 30 sekonda ta' nefaħ ma jaħdmux, stenna 30 sekonda u rrepeti l-operazzjoni.
Wara d-diġestjoni, żid 6-8 ML ta 'medja kompluta biex ittemm id-diġestjoni, ħallat iċ-ċelloli, iġbor is-sospensjoni taċ-ċelluli permezz ta' ċentrifugazzjoni f'900-1000 rpm għal 3 min, armi s-supernatant, żid il-medju ta' lajofilizzazzjoni ppreparat, daqqa bil-mod b'pipetta biex tagħmel iċ-ċelloli omoġenji, aqsam iċ-ċelloli f'tubi tal-lijofilizzazzjoni, 1-1.5 ml għal kull tubu, ittikkettja t-tubi tal-lijofilizzazzjoni bl-isem taċ-ċelloli, il-ħin tal-lijofilizzazzjoni u l-operatur, u poġġi t-tubi tal-lijofilizzazzjoni biċ-ċelloli f'ħitan ħoxnin kaxxi tal-fowm. Iċ-ċelloli tqiegħdu f'kaxxa tal-fowm b'ħitan ħoxnin fi friġġ ta '4 ° C għal 10-30 min u mbagħad imqiegħda fi friġġ -80 ° C matul il-lejl flimkien mal-kaxxa tal-fowm.
Kif tixtri mezzi għall-iffriżar taċ-ċelloli?
Jekk inti interessat tagħna Midja tal-Ffriżar taċ-Ċelloli jew għandek xi mistoqsijiet, jekk jogħġbok ikteb e-mail lil info@antiteck.com, aħna nwieġbuk kemm jista 'jkun malajr.