L-għan tal- ELISA it-test huwa li jipprovdi bażi sperimentali preċiża għall-esperiment, u biex tiġi żgurata l-affidabbiltà tad-dejta sperimentali, fil-proċess sperimentali għandhom jaderixxu mal-kontroll komprensiv tal-kwalità, u l-proċess kollu ta 'kontroll tal-kwalità, fil-ġbir ta' kampjuni għandu jlesti pjan qabel .
Katalgu: Tagħmir Għall-Elisa Kit Manufacturing
1. Volum tal-kampjun miġbur għal kull assaġġ immunosorbent marbut ma 'enżimi = tip ta' assaġġ 100ulx, jekk iridu jsiru bjar multipli, volum tal-kampjun miġbur = tip ta 'assaġġ 100ulx x 2.
2. Jekk il- ELISA kampjun jinġabar u ttestjat fi żmien ġimgħa, jista 'jinħażen f'2-8 °C. Jekk it-test ma jsirx fil-ħin, jekk jogħġbok aqsam il-kampjun u ffriżah f'-20 ° C jew -80 ° C biex tevita l-iffriżar u t-tidwib ripetuti.
3. Il-firxa ta' skoperta tal-kit ELISA mhijiex ugwali għall-firxa ta' konċentrazzjoni tal-analite fil-kampjun. Huwa rakkomandat li tiġi stmata l-konċentrazzjoni ta 'l-analite fil-mudell permezz tal-letteratura rilevanti u tiddetermina l-għażla permezz ta' pre-esperimentazzjoni qabel l-esperiment.
4. Il-kampjuni tas-serum ELISA għandhom jinġabru b'attenzjoni biex tiġi evitata l-emolisi, peress li l-liżi tal-eritroċiti tirrilaxxa sustanzi b'attività perossidażi, u l-illustrazzjonijiet emolizzati jistgħu jżidu l-iżvilupp tal-kulur mhux speċifiku.
5. Biex tiġi żgurata l-eżattezza tat-test ta 'l-awrina, meta tuża ġbir ta' ELISA, għandha tinġabar sew kampjuni ta 'awrina u preservazzjoni, ġbir ta' kontenituri ta 'l-awrina għandu jkun nadif u niexef, u huwa aħjar li tuża kontenituri li jintremew biex tiġi evitata kontaminazzjoni kkawżata mill-użu ta 'drogi u nadif inqas, kampjuni ta' l-awrina għandhom ikunu friski, wara ż-żamma, għandhom jiġu ttestjati jew maħżuna fil-pront.
6. Il-kampjuni għandhom jiġu ttestjati friski jekk ikun hemm kontaminazzjoni batterika, il-batterju jista 'jkun fih HRP endoġenu, li jipproduċi wkoll reazzjoni pożittiva falza. Jekk tinħażen fil-friġġ għal żmien twil wisq, li fih tista 'sseħħ il-polimerizzazzjoni, il-metodu indirett ta' ELISA fl-isfond ta 'Lakeview japprofondixxi.
7. Fl-esperimenti ta 'proċessar ta' kampjuni ELISA, iffriżar u tidwib ripetut tal-kampjun se jnaqqsu l-qawwa tal-proteina, għalhekk biex il-kampjun jiġi ttestjat għal testijiet multipli, huwa rakkomandabbli li jiġi ffriżat numru żgħir ta 'porzjonijiet.
Kampjuni likwidi: serum, plażma, awrina, supernatant taċ-ċelluli, fluwidu ċerebrospinali, eċċ.
Ċelloli kkultivati
Kampjuni tat-tessuti
B'mod ġenerali, il-kampjuni tas-serum ELISA mkejla fi żmien 5 ijiem jistgħu jitqiegħdu f'4°C, kampjuni mbagħad maħżuna fil-friġġ għal żmien twil wisq se jwasslu għall-polimerizzazzjoni tas-serum IgG, huwa l-isfond reaġent tal-metodu indirett approfondit, aktar minn a ġimgħa biex tiddetermina l-ħtieġa għal ħażna ta '-20 °C, serum iffriżat maħlul, konċentrazzjoni lokali ta' proteina, maqsuma b'mod irregolari, għandha titħallat kompletament u tevita l-ġenerazzjoni ta 'bżieżaq tal-arja.
Kampjuni tas-serum imċajpra jew preċipitati għandhom jiġu ċentrifugati jew iffiltrati l-ewwel u mbagħad iċċarati qabel l-ittestjar.
Il-kampjuni tas-serum ELISA għall-kejl tal-antikorpi għandhom jinħażnu għal testijiet multipli, fi kwantitajiet żgħar fuq is-silġ.
Il-preservazzjoni tas-serum ELSA għandha tinġabar biss b'attenzjoni għall-operat asettiku, u preservattivi xierqa jistgħu wkoll jiġu miżjuda. Kampjuni pożittivi foloz ikkawżati minn antikoagulazzjoni mhux kompluta minħabba l-interferenza ta 'elementi ta' fibrina huma rakkomandati li ma tużax antikoagulant, speċjalment antikoagulant eparina.
Serum: koagulazzjoni privata tad-demm tat-temperatura tal-kamra ELISA għal 10-20 minuta, ċentrifugazzjoni għal madwar 20 minuta (2000-3000 rpm). Is-supernatant għandu jinġabar b'attenzjoni u jerġa' jiġi ċentrifugat jekk isseħħ preċipitazzjoni waqt il-ħażna.
Plażma: EDTA jew ċitrat tas-sodju għandhom jintgħażlu bħala antikoagulanti skont ir-rekwiżiti tal-kampjuni tal-assaġġ immunosorbenti marbuta mal-enżimi, imħallta għal 10-20 minuta, ċentrifugati għal madwar 20 minuta (2000-3000 rpm), u s-supernatant għandu jinġabar bir-reqqa u ċentrifuga mill-ġdid jekk jifforma preċipitat
Awrina: miġbura f'tubi sterili, u ċentrifugata għal madwar 20 minuta (2000-3000 rpm), is-supernatant inġabar bir-reqqa, u għandu jerġa 'jiġi ċentrifugat jekk iffurmat preċipitat waqt il-preservazzjoni. Il-fluwidu torakoaddominali u l-fluwidu ċerebrospinali jirreferu għall-prattika.
Supernatant tal-kultura taċ-ċelluli: Meta tiskopri komponenti sekretorji tal-ELISA, iġbor f'tubi sterili, ċentrifuga għal madwar 20 minuta (2000-3000 rpm) u iġbor bir-reqqa s-supernatant, u meta tiskopri komponenti intraċellulari, iddilwa s-sospensjoni taċ-ċelluli b'PBS (PH 7.2-7.4), u l-konċentrazzjoni taċ-ċelluli tilħaq madwar 1 miljun / ml, permezz ta 'friża ripetuta- tidwib biex jeqirdu ċ-ċelloli u jirrilaxxa l-komponenti intraċellulari.
Kampjuni tat-tessut: Wara li taqta 'kampjuni ELISA, iżenhom, żid ċertu ammont ta' PBS, PH 7.4, ffriżahom malajr b'nitroġenu likwidu, u żommhom f'riżerva. Wara li l-kampjuni jiddewbu, żomm temperatura ta '2-8 ° C fi kwalunkwe ħin, żid ċertu ammont ta' PBS (PH 7.4), omoġenizza l-kampjuni bis-sħiħ bl-idejn jew omoġenizzatur, iċċentrifuhom għal madwar 20 minuta (2000-3000 rpm). ), iġbor is-supernatant bir-reqqa. Is-supernatant inġabar bir-reqqa, porzjon wieħed inqasam għall-ittestjar, u l-bqija ġie ffriżat u mwarrab.
Il-kampjuni tal-ELISA għandhom jiġu estratti kemm jista 'jkun malajr wara l-ġbir, u l-estrazzjoni għandha titwettaq skont il-letteratura rilevanti, u t-test għandu jsir kemm jista' jkun malajr wara l-estrazzjoni.
Metodi ta 'analiżi ELISA huma metodi ta' sandwich ta 'antikorpi doppji diretti, indiretti, ibbażati fuq il-kompetizzjoni, li minnhom il-metodu dirett u l-metodu ta' kompetizzjoni huma inqas użati, għandhom ikunu l-aktar metodu ta 'sandwich ta' antikorpi doppji, li għandu vantaġġi ovvji fl-ispeċifiċità tal-ġene tas-sensittività.
L-antiġenu jiġi immobilizzat fuq il-klassi ELISA, u mbagħad l-antiġenu jiġi skopert direttament bl-antikorp ittikkettat bl-enżimi.
Meta mqabbel ma 'oħrajn tipi ta' ELISA esperimenti, dirett ELISA esperimenti għandhom inqas passi, skoperta veloċi, l-ebda ħtieġa li jintużaw antikorpi sekondarji, jevitaw reattività inkroċjata, u r-riżultati tat-test mhumiex suxxettibbli għal żball.
Madankollu, minħabba li l-antiġen ta 'ELISA dirett mhuwiex iffissat speċifikament, il-proteina fil-mira u proteini oħra ta' impurità fil-kampjun se jingħaqdu mal-verżjoni ELISA, l-isfond sperimentali se jkun ogħla, u f'ELISA dirett kull proteina fil-mira teħtieġ tipprepara antikorp primarju li jistgħu jorbtu speċifikament miegħu, l-esperiment huwa inqas flessibbli. Barra minn hekk, minħabba li ma jintuża l-ebda antikorp sekondarju, is-sinjal ma jiġix amplifikat, u jnaqqas is-sensittività tal-assaġġ.
L-antiġenu jiġi immobilizzat fuq il-klassi ELISA, u mbagħad l-antiġenu jiġi skopert direttament bl-antikorp ittikkettat bl-enżimi.
Meta mqabbel ma 'tipi oħra ta' esperimenti ELISA, esperimenti ELISA diretti għandhom inqas passi, skoperta veloċi, l-ebda ħtieġa li jintużaw antikorpi sekondarji, jevitaw reattività inkroċjata, u r-riżultati tat-test mhumiex suxxettibbli għal żball.
Madankollu, minħabba li l-antiġen ta 'ELISA dirett mhuwiex iffissat speċifikament, il-proteina fil-mira u proteini oħra ta' impurità fil-kampjun se jingħaqdu mal-verżjoni ELISA, l-isfond sperimentali se jkun ogħla, u f'ELISA dirett kull proteina fil-mira teħtieġ tipprepara antikorp primarju li jistgħu jorbtu speċifikament miegħu, l-esperiment huwa inqas flessibbli. Barra minn hekk, minħabba li ma jintuża l-ebda antikorp sekondarju, is-sinjal ma jiġix amplifikat, u jnaqqas is-sensittività tal-assaġġ.
L-antiġen li qed jiġi ttestjat huwa inkapsulat bejn żewġ antikorpi, li wieħed minnhom jimmobilizza l-antiġen fuq trasportatur, jiġifieri, l-antikorp tal-qbid, u l-ieħor huwa l-antikorp ta’ skoperta, li jista’ jiġi ttikkettjat b’enżimi għad-determinazzjoni diretta tal-ammont ta’ antiġen, jew mhux tikkettati u mbagħad imkejla b'antikorpi sekondarji ttikkettjati b'enżimi, li għandhom jintgħażlu bir-reqqa biex jevitaw merkanzija ta' reazzjoni inkroċjata li tikkompeti għall-istess ammont ta' siti li jgħaqqdu l-antiġeni.
Jekk l-antiġenu huwa antiġenu, l-antiġenu se jikkompeti mal- antikorp immarkat b'enżimi biex jorbot l-antikorp ittikkettat bl-enżimi fuq it-trasportatur tal-fażi solida. Jekk is-sustanza li għandha tiġi skoperta hija antikorp, l-antikorp li għandu jiġi skopert se jikkompeti mal-antikorp tikkettat bl-enżimi fis-sistema biex jorbot mal-antiġen imgeżwer fuq it-trasportatur solidifikat mill-ġdid, aħsel l-antikorp tikkettat b'enżima marbut b'mod kompetittiv billi taħsel. , u fl-aħħar żid is-sottostrat biex tiżviluppa l-kulur.
Kompetizzjoni ELISA hija daqsxejn aktar ikkumplikata meta mqabbla mat-tliet metodi ta 'hawn fuq, iżda t-tliet tipi ta' ELISA ta 'hawn fuq huma adattati għall-forma ta' ELISA tal-kompetizzjoni, il-punt ewlieni tagħha huwa li tiskopri kampjuni impuri u riproduċibbiltà għolja tad-dejta, iżda hemm il-problema ta 'fqir. sensittività ġenerali u speċifiċità.
| Inkapsulament | L-antiġeni jew l-antikorpi jistgħu jiġu assorbiti fiżikament fuq il-wiċċ tat-trasportatur tal-fażi solida, minħabba li l-parti idrofobika bejn il-proteina u l-assorbiment tal-wiċċ tal-polistirene, wara l-assorbiment tista 'żżomm ir-reazzjoni antiġenika u attività immuni oħra. |
| Tikkettjar | L-antiġeni jew l-antikorpi jistgħu jiġu marbuta b'mod kovalenti ma' enżimi biex jiffurmaw konjugati ta' l-enżimi li għadhom iżommu l-attività immuni tagħhom u l-karatteristiċi katalitiċi ta' l-enżimi. |
| Żvilupp tal-kulur | Wara li l-konjugat tal-enżima jingħaqad mal-antiġen jew antikorp korrispondenti inkapsulat fit-trasportatur tal-fażi solida, huwa wkoll immobilizzat fuq it-trasportatur tal-fażi solida, u r-reazzjoni tal-iżvilupp tal-kulur tista 'sseħħ wara li żżid l-enżima-sottostrat, u l-kontenut relattiv tal-antiġen jew antikorp jista 'jiġi kkalkulat skond l-isfumatura tal-kulur tar-reazzjoni. |
Speċifiċità: L-ispeċifiċità tal-kit ELISA hija relatata mal-komponent ewlieni tal-kit, il-par ta 'antikorpi, jekk wieħed mill-pari ta' antikorpi huwa antikorpi multipli, l-ieħor għandu jkun antikorp monoklonali, huwa rakkomandat li tuża antikorp monoklonali doppju.
Sensittività: Is-sensittività tirrifletti l-abbiltà tal-kit li jiskopri l-ammont minimu tas-sustanza li għandha tiġi skoperta, l-utent jista 'jagħżel il-kit xieraq skond in-numru ta' indikaturi li għandhom jiġu skoperti fil-kampjuni tagħhom, jekk l-ammont ta 'indikaturi li għandhom jiġu skoperti huwa baxx ħafna, il-kit ġenerali ma jistax jissodisfa r-rekwiżiti, tista 'tagħżel kit ELISA sensittiv ħafna.
Ripetibbiltà: esperimenti xjentifiċi jeħtieġu ripetibbiltà, ġenerali kits ELISA, u perjodu fi ħdan il-pjanċa u l-koeffiċjent ta 'varjazzjoni interplate għandhom jiġu kkontrollati fi żmien 15%.
Sempliċità: Iqsar iż-żmien sperimentali u aktar konvenjenti l-operazzjoni, aktar probabbli l-kit ikun milqugħ mill-utent, taħt il-kundizzjoni li tiġi żgurata data ta 'kwalità għolja.
| Mistoqsija | Kawżi possibbli | Soluzzjoni |
|---|---|---|
| Sfond għoli jew kontroll negattiv huwa għoli biss Irbit mhux speċifiku tal-antikorpi Il-konjugat tal-enzima huwa kkonċentrat wisq Temperatura ta 'inkubazzjoni għolja wisq Espożizzjoni qabel l-użu mill-ġdid tas-sottostrat Ħin ta' waqfa twil wisq qabel il-qari tal-pjanċa | Bjar ta 'kontroll negattiv huma kkontaminati minn kampjuni ta' kontroll pożittiv Is-soluzzjoni tal-imblukkar mhix adattata, ibdel is-soluzzjoni tal-imblukkar Jekk jogħġbok iċċekkja jekk il-konjugat tal-enzima huwiex dilwit skont l-istruzzjonijiet Iċċekkja jekk it-temperatura tal-inkubatur hijiex korretta u stabbli Il-qari għandu jittieħed fi żmien 3 minuti wara ż-żieda tas-soluzzjoni tat-terminazzjoni f'post mudlam, protett mid-dawl. | Txerredx is-soluzzjoni tal-ħasil barra mill-bjar meta taħsel |
| Il-kurva standard tal-kurva standard hija tajba, iżda l-kampjun m'għandu l-ebda sinjal ta 'skoperta Sustanzi oħra fil-kampjun jaffettwaw/jagħbu l-iskoperta Valuri baxxi foloz minħabba l-effett HOOK minħabba konċentrazzjonijiet għoljin ta 'ditekters fil-kampjun | L-ebda jew livell baxx ħafna ta 'skoperta fil-kampjun Dilwizzjoni xierqa biex titnaqqas l-interferenza ta 'sustanzi oħra, jew dilwizzjoni serjali, irkupru ta' skoperta Iddilwa l-kampjun f'multipli xierqa biex iżżomm il-konċentrazzjoni tat-test fil-medda ta' skoperta tal-kit | Stabbilixxi referenza interna u esperimenta mill-ġdid |
| Ripetibbiltà fqira Reaġent mhux imħallat Impuritajiet jew preċipitati fil-kampjun maqtugħa mill-ponta tal-pipetta | Bżieżaq tal-arja fil-bjar Żgura taħlit adegwat tar-reaġenti Qabel l-użu; ċentrifuga Oqgħod attent meta żżid likwidu | Uża ponta tal-labra biex tagħżel il-bżieżaq tal-arja |
