Katalgu: Tagħmir-Għal-Elisa-Kit-Manifattura
Il-prinċipju ta ' (ELISA) assaġġ immunosorbenti marbut mal-enżimi) huwa kif ġej:
Immunoassay huwa metodu li juża l-prinċipju ta 'rikonoxximent selettiv u speċifiku ħafna u rbit ta' antikorp speċifiku ma 'antiġen jew semi-antiġen biex janalizza u jiddetermina l-antikorp jew antiġen li għandu jitkejjel.
F'ELISA, ir-rikonoxximent immuni jitwettaq billi jiksi pjanċa ta' 96 bir b'antikorpi magħmula mill-polistirene u mbagħad jintużaw l-antikorpi biex jirrikonoxxu l-antiġenu li jrid jitkejjel (ġeneralment bijomarkatur tal-proteina ta' mard, virus, batterji, eċċ.) u jassorbi l-antiġenu. mis-soluzzjoni kumplessa li għandha titkejjel fuq il-wiċċ tal-pjanċa ta' 96 bir. Sussegwentement, jintużaw antikorpi b'Horseradish Peroxidase (HRP), antikorpi fluworexxenti jew radjutikkettati biex joħorġu s-sinjal ta' rikonoxximent jew direttament jew indirettament. Fl-aħħarnett, il-konċentrazzjoni tal-antiġen fil-mira fil-kampjun li jrid jitkejjel hija kkalkulata bl-użu ta' informazzjoni bħall-intensità tas-sinjal u l-gradjent tal-konċentrazzjoni tal-kampjun standard.
L-antikorp huwa inkapsulat fuq platt ta’ 96-il tar. Peress li f'ELISA, il-pjanċa hija magħmula minn polistirene, li fih ċirku tal-benżina b'residwi ta 'amino aċidi tal-antikorp b'forza gravitazzjonali simili għal azzjoni ta' stivar π-π, flimkien ma 'effetti elettrostatiċi u idrofobiċi, l-antikorp jista' jiġi adsorbit fuq il-wiċċ tiegħu . L-antikorpi mhux adsorbiti mbagħad jinħaslu b'buffer u tiżdied soluzzjoni ta' imblukkar li jkun fiha ġelatina jew Albumina tas-Serum Bovini (BSA) biex tissiġilla l-porzjon tal-antikorp mhux marbut tal-pjanċa tal-enżima. L-iskop taż-żieda tas-soluzzjoni tal-għeluq huwa li jipprevjeni proteini oħra milli jassorbu fuq il-pjanċa 96-well minħabba effetti elettrostatiċi jew idrofobiċi, li jikkawżaw sinjali pożittivi foloz u jinterferixxu ma 'esperimenti sussegwenti.
Immunor-rikonoxximent Wara l-kisi tal-pjanċa 96-well bl-antikorp, il-kampjun li għandu jiġi ttestjat jiġi miżjud u inkubat f'37 ° C għal xi żmien, ġeneralment 1-2 sigħat. F'dan iż-żmien, l-antikorp fuq il-pjanċa mmarkata bl-enżimi jeħel mal-antiġen li jrid jiġi ttestjat għal rikonoxximent speċifiku. Il-kwalità tal-antikorp hija kritika hawnhekk, peress li antikorp tajjeb jorbot l-antiġen b'mod speċifiku u effiċjenti mingħajr ma jiġi affettwat minn komponenti oħra tal-kampjun li jrid jiġi ttestjat, bħal bijomolekuli, proteini u melħ inorganiku.
Aħsel il-pjanċa li tinsab f'ELISA. Aħsel l-antiġen mhux marbut, żid l-antikorp ta’ rikonoxximent li jikkorrispondi għal dak l-antiġen u kompli inkuba f’37°C għal 1-2 sigħat, segwit minn aħsel l-antikorpi li mhumiex imwaħħla mal-antiġen.
Ħruġ tas-sinjal tikkettat bl-enzima Antikorp sekondarju tikkettat bl-enżima b'tikkettjar Horseradish Peroxidase (HRP) huwa miżjud għall-irbit mal-antikorp standard. Wara 30 minuta ta 'inkubazzjoni, l-antikorp sekondarju mhux konjugat jinħasel u jiġi miżjud żviluppatur tal-kulur biex tiżviluppa l-kulur. Il-konċentrazzjoni tal-antiġen hija ddeterminata abbażi tar-riżultat tal-iżvilupp tal-kulur. Huwa ġeneralment maħsub li l-konċentrazzjoni ta 'antiġen hija korrelatata b'mod pożittiv mal-intensità tal-luminexxenza wara l-iżvilupp tal-kulur.
Fil-każ ta 'antikorp li jikkompeti mal-antiġen, per eżempju, immedjatament wara ż-żieda tal-antiġen li għandu jiġi ttestjat fit-tieni pass tal-operazzjoni ta' immunosandwiching ta 'hawn fuq, l-antiġen ittikkettat bl-enżimi huwa miżjud sabiex jikkompeti mal-antiġen li għandu jiġi ttestjat għal jagħraf l-antikorp fuq il-pjanċa mmarkata bl-enżimi. Meta l-konċentrazzjoni tal-antiġenu li jrid jiġi ttestjat tkun ogħla, inqas antikorpi ttikkettjati b'enzimi jistgħu jitwaħħlu mal-antikorpi fuq il-pjanċa tal-enżima, u se joħroġ inqas sinjal. B'dan il-mod, il-konċentrazzjoni tal-kampjun li għandu jiġi ttestjat hija inversament korrelata mas-sinjal kromoġeniku tal-enzima.
