Mill-1886, meta Goldstein ivvinta s-sors tal-jone użat komunement fl-ispettrometri tal-massa bikrija, sal-1942, meta l-ewwel spettrometru tal-massa b'fokus wieħed ġie kummerċjalizzat MALDI-TOF l-ispettrometrija tal-massa kienet bażikament fl-istadju ta 'żvilupp teoretiku. L-iżvilupp u l-irfinar sussegwenti tal-ispettrometrija tal-massa MALDI-TOF f'tekniki ta 'jonizzazzjoni u tekniki analitiċi wasslu għall-applikazzjoni rapida tagħha f'ħafna oqsma bħall-ġeoloġija, ir-riċerka spazjali, il-kimika ambjentali, kimika organika, u farmaċewtiċi.
Spettrometrija tal-massa MALDI-TOF qed issir teknika ta 'appoġġ maġġuri għall-identifikazzjoni u l-analiżi tal-proteini billi jiġi ddeterminat il-proporzjon tal-massa għall-iċċarġjar (m/z) tal-jonji tal-kampjun għall-analiżi tal-kompożizzjoni u strutturali. L-identifikazzjoni ta 'spots ta' proteina separati b'elettroforeżi tal-ġel f'żewġ direzzjonijiet, li huma kbar fin-numru u żgħar fil-kwantità, titwettaq billi titfittex fid-database tal-proteini għal proteini li jaqblu ma 'dawn il-parametri bl-użu ta' diversi parametri ta 'proprjetà bħal massa molekulari relattiva, punt iżoelettriku, sekwenza, Kompożizzjoni ta 'aċidu amminiku, marki tas-swaba' tal-massa tal-peptidi, eċċ Jekk ma jinstabx fid-database, huwa possibbli li tkun ġiet skoperta proteina ġdida u titwettaq analiżi tas-sekwenza biex tkompli tisintetizza sondi tad-DNA biex tesprimiha, iżolata u tidentifikaha.
L-iżvilupp u l-irfinar sussegwenti tal-ispettrometrija tal-massa MALDI-TOF f'jonizzazzjoni u tekniki analitiċi wasslu għall-applikazzjoni rapida tagħha f'varjetà ta 'oqsma bħall-ġeoloġija, ir-riċerka spazjali, il-kimika ambjentali, il-kimika organika u l-farmaċewtiċi. Madankollu, anki wara l-emerġenza ta 'żewġ tekniki ta' spettrometrija tal-massa ta 'jonizzazzjoni artab, desorbiment tal-plażma (PD) u bumbardament ta' atomu mgħaġġel (FAB), il-mases molekulari relattivi analizzati mill-ispettrometrija tal-massa kienu biss fil-medda ta 'ftit eluf. Il-bidla reali kienet rappreżentata mill-emerġenza ta 'żewġ tekniki ġodda ta' jonizzazzjoni f'nofs is-snin tmenin: jonizzazzjoni elettrospray (ESI) u jonizzazzjoni ta 'desorbiment bil-laser assistita minn matriċi (MALDI), li t-tnejn għandhom Is-sensittività għolja u l-firxa ta' sejbien ta 'kwalità għolja ta' dawn iż-żewġ tekniki jagħmluha possibbli li jinstabu bijomolekuli b'mases molekulari relattivi sa mijiet ta 'eluf fil-livelli fmol (1980-10) u anke amole (15-10), u b'hekk jiftaħ qasam ġdid fjamant ta' spettrometrija tal-massa - spettrometrija tal-massa bijoloġika, u iwassal għall-applikazzjoni mifruxa u l-iżvilupp tal-ispettrometrija tal-massa fil-qasam tax-xjenza tal-ħajja. Dan wassal għall-applikazzjoni wiesgħa u l-iżvilupp tal-ispettrometrija tal-massa fix-xjenzi tal-ħajja.
L-ispettrometrija tal-massa MALDI tista 'tipprovdi metodu ta' analiżi b'ħafna komponenti rapidu u solvut faċilment b'sensittività għolja, selettività u preċiżjoni, u l-ambitu tal-applikazzjoni tagħha jaqbeż ħafna dak ta 'radjuimmunoassay u skoperta kimika. L-ispettrometrija tal-massa bijoloġika MALDI-TOF tista 'tintuża prinċipalment fil-mediċina tal-laboratorju għall-analiżi tas-sekwenza tal-komponenti, analiżi tal-istruttura, determinazzjoni tal-piż molekulari u determinazzjoni tal-kontenut ta' kull komponent f'organiżmi ħajjin.
L-istudju tal-MALDI-TOF molekulari tal-aċidi nuklejċi sar wieħed mid-direzzjonijiet ta 'riċerka l-aktar dinamiċi fl-oqsma tal-kimika tal-ħajja, il-bijoloġija molekulari u l-mediċina. Permezz ta 'spettrometrija tal-massa bijoloġika moderna, nistgħu mhux biss niksbu l-massa molekulari ta' oligonukleotidi, iżda wkoll l-informazzjoni tas-sekwenza tagħha permezz ta 'tekniki rilevanti.
MALDI-TOF ta 'kull iżolat batterjali jista' jintuża biex jidentifika batterji bbażati fuq il-mudell tal-peptide uniku jew il-marki tas-swaba 'ta' kull batterju, u Hsu uża spettrometrija tal-massa tandem biex jidentifika s-Salmonella J. Minħabba l-kontenut għoli ta 'proteini fil-batterja, l-ispettrometrija tal-massa bijoloġika tista' jintużaw komunement għall-identifikazzjoni ta' ġeneri, speċi u razez batterjali; u l-ispettrometrija tal-massa tandem tista 'timmira wkoll il-kompożizzjoni tal-aċidu xaħmi ta' zokkor jew lipidi; barra minn hekk, il- Billi tipproċessa kampjuni bijoloġiċi, l-ispettrometrija tal-massa tandem tista 'wkoll tiskopri u tidentifika batterji u spori patoġeniċi fil-livell ta' batterja waħda; analiżi ta 'komponenti speċifiċi tal-lipidi tipprovdi ħarsa lejn il-vijabbiltà u l-infezzjoni potenzjali ta' batterji patoġeniċi fil-kampjun.
L-applikazzjonijiet tal-ispettrometrija tal-massa fl-analiżi farmaċewtika jinkludu: analiżi tal-komponenti tad-droga sintetika, analiżi tal-kompożizzjoni tad-droga naturali, analiżi tas-sekwenza tal-aċidu amminiku ta 'mediċini peptidi u proteini (inklużi glikoproteini), studji dwar il-metaboliżmu tad-droga u analiżi tal-kompożizzjoni tal-mediċina tal-ħxejjex. Aktar applikazzjonijiet fil-mediċina tal-laboratorju huma l-monitoraġġ tad-droga terapewtika (TDM). Preċedentement, l-iskoperta tad-droga prinċipalment użat tekniki immunokimiċi u kromatografija likwida ta 'prestazzjoni għolja. Għalkemm, it-teknika immunokimika hija sempliċi u faċli biex tużah, il-varjetà ta 'drogi mkejla hija relattivament żgħira. Għalkemm it-teknika tal-kromatografija likwida ta 'prestazzjoni għolja tiddetermina aktar tipi ta' mediċini, l-affidabilità tal-karatterizzazzjoni hija fqira. Madankollu, kromatografija likwida flimkien ma 'spettrometrija tal-massa (LC.MS) hija preċiża u rapida għall-iskoperta tad-droga u tista' tintuża għal kważi d-drogi kollha, bħal mediċini kontra l-kanċer, immunosoppressanti, antibijotiċi u mediċini kardjovaskulari, u t-teknoloġija LC.MS hija mistennija li tkun l-aktar għodda qawwija għall-iskoperta tad-droga.
L-ispettrometrija tal-massa MALDI-TOF taħdem kif ġej:
Il-laser iħeġġeġ lill-batterji fuq il-pjanċa fil-mira b'sottostrat li jippermetti li l-proteini batterjali jtiru f'tubu vakwu. Id-ditekter jiskopri d-differenza fil-ħin tal-proteini tat-titjira biex joħloq profil li mbagħad jitqabbel mal-informazzjoni fid-database biex jiġu derivati l-ispeċi possibbli ta 'batterja.
il MALDI-TOF MS mainframe jikkonsisti f'żewġ partijiet, is-sors tal-joni (MALDI) u l-analizzatur tal-massa tal-ħin tat-titjira (TOF). Il-prinċipju ta 'MALDI huwa li tuża sors tal-laser biex irradja l-kampjun li għandu jiġi eżaminat mal-matriċi biex tifforma film kristallin, il-matriċi tassorbi l-enerġija mill-laser biex tittrasferixxi għall-bijomolekuli, u l-proċess ta' jonizzazzjoni jittrasferixxi protoni lejn jew mill-bijomolekuli biex jonizza l-bijomolekuli. Il-prinċipju ta 'TOF huwa li l-joni huma aċċellerati mill-kamp elettriku biex itiru mit-tubu tat-titjira, u l-m/z (jiġifieri, l-m/z tal-joni huwa proporzjonali għall-ħin tat-titjir tal-joni) u l-valur tas-sinjal jinkisbu skond il-ħin tal-wasla tad-ditekter u n-numru ta 'jonji, u b'hekk jiffurmaw il-mudell tal-quċċata tal-ispettrometrija tal-massa korrispondenti. L-ispettri miksuba fuq il-magna jistgħu jitqabblu mar-referenza komuni fid-database biex jinkisbu l-eqreb razez, u l-punteġġi ta 'identifikazzjoni korrispondenti jingħataw skond id-distanza ta' omoloġija biex jinkisbu r-riżultati ta 'identifikazzjoni finali.
Il-prinċipju ta 'dan il-metodu huwa li tikkristallizza l-kampjun b'taħlita ta' matriċi ta 'molekula żgħira (aċidu ċinnamiku, aċidu tal-mustarda, u l-artikoli tagħhom). Meta l-lejżer UV (337 nm) irradja l-kristall, il-molekuli tal-matriċi jassorbu l-enerġija biex jiddesorbu u jonizza l-kampjun bil-molekuli tal-matriċi. Il-jonji ġġenerati mill-kampjun jakkwistaw l-istess enerġija kinetika taħt l-azzjoni ta 'kamp elettriku li jaċċellera u jgħaddu minn tubu tat-titjira vakwu mingħajr kamp elettriku, il-joni eħfef huma aktar mgħaġġla u jilħqu d-ditekter qabel, il-jonji itqal jilħqu d-ditekter aktar tard, u l-ħin tat-titjir huwa proporzjonali għal (m/z). il-jonji ġġenerati minn MALDI huma l-aktar joni ċċarġjati waħedhom, u l-quċċati spettrali fl-ispettri tal-massa għandhom korrispondenza waħda għal waħda man-numru tal-massa ta 'kull komponent tal-kampjun, għalhekk MALD-MS huwa l-aktar adattat għall-analiżi tal-peptide taħlitiet wara idroliżi tal-proteini. l-ispettri tal-massa tal-MALDI huma kumulattivi tar-riżultati ta 'skans multipli, li jagħmlu dan l-istrument l-aktar spettrometru tal-massa sensittiv disponibbli llum, adattat għall-analiżi ta' kampjuni ta 'traċċa (fmol-amol).
Il-metodu ta 'jonizzazzjoni elettrospray juża vultaġġ għoli biex jiċċarġja l-qtar li joħorġu mill-kolonna kapillari fit-tarf tad-daħla tal-ispettrometru tal-massa, u taħt l-azzjoni ta' nixxiegħa tal-gass N2 inversa, il-qtar jevapora s-solvent, il-wiċċ jiċkien, il-wiċċ id-densità ta 'ċarġ tiżdied, u l-qtar jinfaqa' f'sub-qtar iċċarġjati. Il-vultaġġ fuq il-wiċċ tal-qtar huwa tant qawwi li l-analite jonizza u jidħol fl-analizzatur tal-massa bħala joni ċċarġjati singoli jew b'ħafna. Il-qċaċet spettrali tal-massa juru serje ta 'quċċati ta' massa-to-charge għal dan il-kompost bi ħlasijiet differenti, li jistgħu jiġu kkonvertiti f'qċaċet ta 'jone molekulari ċċarġjati waħedhom permezz ta' kalkoli tas-softwer. Din it-teknika tippermetti l-analiżi tal-kampjuni fil-medda tal-fmolamol.
L-ispettrometrija tal-massa tandem tippermetti analiżi selettiva ta' komponent ta' taħlita mingħajr ma tissepara l-gruppi. Il-joni ġenitur tal-qċaċet tal-jone molekulari tal-komponenti kollha jinkisbu mill-analizzatur tal-massa tal-ewwel stadju, u l-joni ġenitur għal aktar analiżi jintgħażlu minn overrunner tal-massa.
il framment joni (jonji bint) huma ġġenerati, u l-joni bint jiġu mitmugħa fl-analizzatur tal-massa tat-tieni stadju biex jinkisbu l-qċaċet tal-frammenti tal-joni ġenitur. Billi tistudja r-relazzjoni tal-qsim bejn il-joni ġenitur u bint, tista 'tinkiseb informazzjoni strutturali ta' peptidi u proteini.
Huwa tip ġdid ta 'spettrometru tal-massa bijoloġiku introdott f'dawn l-aħħar snin. L-ispettrometru tal-massa primarju tiegħu huwa sors ta 'jonizzazzjoni elettrospray b'analizzatur tal-massa quadrupole, u t-tieni spettrometru tal-massa huwa sostitwit minn analizzatur tal-massa tal-ħin tat-titjira, li jtejjeb ir-riżoluzzjoni u s-sensittività tal-istrument u jippermetti analiżi serjali ta' kampjuni ta 'traċċa.
Preparazzjoni qabel il-kampjun
L-ispettrometri tal-massa MALDI-TOF MS bħalissa mhumiex adattati għal kulturi mħallta, li għandhom ikunu mikro-organiżmi frazzjonali puri. L-għażla tal-mezz tal-kultura, tal-pellet solidu u tal-mezz likwidu teoretikament tvarja kemmxejn u ġeneralment mhix affettwata fil-prattika. Medju solidu huwa rakkomandat għall-identifikazzjoni ta' rutina.
Għal midja solida, midja teoretikament selettiva u mhux selettiva mhux se jkollha ħafna effett fuq l-identifikazzjoni tal-ispettrometrija tal-massa, iżda xorta huwa rakkomandat li tipprova tagħżel midja mhux selettiva għall-kultura batterjali. 105-107 kolonji (CFU) huma normalment meħtieġa għall-identifikazzjoni MALDI-TOF MS biex jiffurmaw in-numru ta 'batterji. Il-ħin tal-kultura kif ġej jeħtieġ li jiġi nnutat: perjodu qasir ta 'kultura ġeneralment ma jaffettwax ir-riżultati tal-identifikazzjoni, iżda minħabba li huwa impossibbli li jiġi ddeterminat jekk il-kolonji puri, bħal tkabbir imħallat jistgħux jaffettwaw il-falliment tar-riżultati tal-identifikazzjoni. Għal mikro-organiżmi li jipproduċu l-ispori, iż-żmien ta 'inkubazzjoni twil wisq iwassal għal tnaqqis fis-sinjal tal-quċċata tal-proteina u l-kwalità tal-plott, każijiet bħal dawn jeħtieġ li jiġu identifikati wara l-passaġġ.
Target pittura
Kolonji mikrobiċi huma applikati fil-post ċentrali tal-mira u jinfirxu b'mod uniformi biex jiffurmaw saff irqiq.
Meta tapplika l-mira, huwa meħtieġ li tingħata attenzjoni għal dan li ġej: ammont żgħir wisq ta 'batterji huwa applikat, li jirriżulta f'sinjal ta' analiżi insuffiċjenti u jwassal għal nuqqas ta 'identifikazzjoni; hija applikata wisq batterji jew applikati b'mod irregolari, li jista 'jwassal ukoll għal nuqqas ta' identifikazzjoni. Meta kisi għandu jipprova jkopri ż-żona fil-mira kollha, lil hinn miż-żona fil-mira huwa faċli li tikkawża kontaminazzjoni inkroċjata.
Għall-kolonji mukoid: minħabba li s-sistema ta 'identifikazzjoni prinċipalment tiskopri proteini ribosomali intraċellulari, batterji mukojdi minħabba l-formazzjoni ta' mżiewed mucopolysaccharide extraċellulari iddilwa l-konċentrazzjoni ta 'batterji miksija fuq is-sit fil-mira, li jista' jwassal għal falliment ta 'identifikazzjoni. Għal batterji mukojdi, il-metodi li ġejjin jistgħu jintużaw biex itejbu l-identifikazzjoni: ① Ħallat il-kolonji batterjali mukojdi sew mal-linja ta 'l-inokulazzjoni, u mbagħad aqbad xi kampjuni għal spotting; ② Aħsel bil-mod il-mukus fuq il-wiċċ tal-kolonji b'tampun tal-qoton, u mbagħad aqbad xi kampjuni aktar baxxi għal spotting; ③ Agħżel il-kolonji frazzjonati bil-linja ta 'l-inokulazzjoni f'tubi EP bi 300 μl ta' ilma dejonizzat, xerred għal kollox u aħsel, 16 000 ~ 19 000 × g, ċentrifuga għal 2 min, armi s-supernatant, u ħu l-preċipitat għal spot plate.
Għal kolonji tat-tip niexef: għandha tingħata attenzjoni biex tevita l-ġbir tal-komponenti medji, kemm jista 'jkun fl-istadju bikri tat-tkabbir tal-kolonja huwa picking aktar skars, tista' tipprova tuża aċidu formiku fil- tubu tat-test għall-estrazzjoni qabel il-kisi tal-pjanċa fil-mira.
Fluwidu tal-matriċi
Żid 2μLB likwidu qatra qatra b'pipetta, ħalliha tinxef b'mod naturali, imbagħad żid 1.5μLA likwidu qatra qatra fin-nofs tal-mira, nixxef, u stenna għall-kejl.
Ittestjar abbord
Segwi l-istruzzjonijiet tat-tħaddim tal-istrument MALDI-TOF (inkluż il-kalibrazzjoni qabel il-lott)
Il-ġbir tad-data u t-tqabbilha ma 'database biex tagħti riżultati ta' identifikazzjoni
Biex tiġi żgurata l-affidabbiltà tar-riżultati ta 'identifikazzjoni klinika, ir-riżultati ta' identifikazzjoni miksuba minn MALDI-TOF MS għandhom jiġu riveduti minn professjonisti tal-mikrobijoloġija qabel ir-rappurtar, u l-eżattezza tar-riżultati tista 'tiġi ġġudikata matul il-proċess ta' reviżjoni billi tgħaqqad is-sors tal-kampjun, ir-riżultati tat-tbajja ', il-morfoloġija , kundizzjonijiet tal-kultura u karatteristiċi oħra, u identifikazzjoni sekondarja jew esperimenti awżiljarji addizzjonali għandhom jitwettqu għal riżultati suspettużi, u jekk iseħħu riżultati inkonsistenti, għandhom jiġu investigati fil-pront raġunijiet u jagħtu spjegazzjonijiet raġonevoli. Peress li l-interpretazzjoni tar-riżultati ta 'sistemi MALDI-TOF MS differenti mhijiex l-istess, dan li ġej huwa eżempju ta' rappurtar u interpretazzjoni ta 'żewġ riżultati biss li huma aktar użati fis-suq, għal sistemi MALDI-TOF MS oħra, irreferi għal l-istruzzjonijiet tal-manifattur.
