Katalgu: Tagħmir-Għal-Elisa-Kit-Manifattura
ELISA, l- assaġġ immunosorbenti marbut ma' enzimi, hija klassi komunement użata ta 'tekniki immunoenzimatiċi. Il-metodu ewlieni huwa li jassorbi antiġen jew antikorp magħruf fuq il-wiċċ ta 'trasportatur ta' fażi solida, imbagħad inkuba l-antikorp jew antiġen immarkat b'enżimi (akkoppjati) miegħu, żid żviluppatur tal-kulur biex tiżviluppa l-kulur, tiddetermina d-differenza bejn il-kulur tal-analite li jrid jitkejjel u l-kulur tal-istandard permezz ta 'markatur tal-enżima, u plottja l-kurva tal-attività tal-enżima biex tikseb il-konċentrazzjoni tal-analite li trid titkejjel.
Hemm seba' passi involuti fit-twettiq ta' ELISA:
ELISA dirett huwa li jimmobilizza l-antiġen fuq il- ELISA pjanċa u mbagħad uża l-antikorp tikkettat bl-enżimi biex tiskopri l-antiġen direttament.
Meta mqabbla ma 'tipi oħra ta' esperimenti ELISA, esperimenti ELISA diretti għandhom inqas passi, skoperta aktar mgħaġġla, u l-ebda ħtieġa li jintużaw antikorpi sekondarji, biex tiġi evitata reattività inkroċjata, ir-riżultati tal-kejl mhumiex suxxettibbli għal żball. Madankollu, minħabba li l-antiġen ta 'ELISA dirett mhuwiex iffissat speċifikament, il-proteina fil-mira u impuritajiet oħra fil-kampjun se jkunu marbuta mal-pjanċa ELISA, u l-isfond sperimentali se jkun ogħla. U kull proteina fil-mira ta 'ELISA diretta teħtieġ li tipprepara antikorp primarju li jista' jorbot speċifikament magħha, l-esperiment huwa inqas flessibbli. Barra minn hekk, minħabba li ma jintuża l-ebda antikorp sekondarju, is-sinjal ma jiġix amplifikat, u jnaqqas is-sensittività tal-assaġġ.
ELISA indiretta huwa proċess f’żewġ stadji li fih antiġen huwa marbut ma’ pjanċa ELISA, segwit minn proċess f’żewġ stadji li fih jiżdied antikorp ta’ skoperta biex jeħel speċifikament mal-antiġen, segwit biż-żieda ta’ antikorp sekondarju ttikkettjat b’enżima għal skoperta u żvilupp tal-kulur bl-użu tas-sottostrat.
Meta mqabbel ma 'ELISA dirett, ELISA indiretta tuża antikorpi sekondarji ttikkettjati b'enżimi, li huma aktar sensittivi u jeħtieġu inqas antikorpi ttikkettjati, li jagħmilha aktar ekonomika. ELISA indiretta toffri wkoll flessibilità akbar peress li antikorpi primarji differenti jistgħu jintużaw b'antikorp sekondarju wieħed ittikkettat. L-iżvantaġġi ta 'esperimenti ELISA indiretti huma l-possibbiltà ta' reattività inkroċjata (irbit dirett ta 'l-antikorp sekondarju tikkettat bl-enżimi għall-antiġen), li jista' jżid l-isfond, u l-pass addizzjonali ta 'inkubazzjoni ta' l-antikorp sekondarju meta mqabbel ma 'ELISA dirett, li jtawwal iċ-ċiklu sperimentali.
Ġo sandwich ELISA, l-antikorp tal-qbid huwa l-ewwel immobilizzat fil-bjar tal-pjanċa ELISA, u mbagħad jiżdied il-kampjun, segwit mill-antikorp ta 'skoperta. Jekk l-antikorp ta 'skoperta huwa ttikkettjat b'enżima, jista' jissejjaħ ELISA sandwich dirett; jekk l-antikorp ta 'skoperta ma jkunx ittikkettat, huwa wkoll meħtieġ li jintuża antikorp sekondarju tikkettat b'enżima biex jorbot ma' l-antikorp ta 'skoperta, u dan jissejjaħ ELISA sandwich indirett.
Is-sensittività tas-sandwich ELISA hija għolja, hija 2-5 darbiet aktar sensittiva minn ELISA diretta jew indiretta; fl-istess ħin, sandwich ELISA juża żewġ antikorpi speċifiċi biex jeħel mal-antiġen u għandu speċifiċità għolja. Barra minn hekk, is-sandwich ELISA jista 'jiskopri b'mezzi diretti jew indiretti, li huwa aktar flessibbli. L-iżvantaġġ ta 'sandwich ELISA huwa r-rekwiżit għoli għall-antikorpi paired. Jekk ma jkunu disponibbli l-ebda kits standardizzati jew antikorpi paired ittestjati, huma meħtieġa l-adattament u l-ottimizzazzjoni tal-antikorpi paired, peress li huwa importanti li titnaqqas ir-reattività inkroċjata bejn l-antikorpi tal-qbid u l-iskoperta.
il kompetizzjoni ELISA huwa antiġenu pre-inkapsulat fuq trasportatur ta' fażi solida b'antikorp ta' speċifiċità mmarkat b'enżimi. Matul l-esperiment, jiżdied l-antiġen (jew l-antikorp) li jrid jiġi ttestjat. Jekk it-test huwa antiġen, l-antiġen li jrid jiġi ttestjat jikkompeti mal-antiġen pre-inkapsulat fuq it-trasportatur tal-fażi solida biex jorbot l-antikorp ittikkettat bl-enżima; jekk it-test huwa antikorp, l-antikorp li jrid jiġi ttestjat jikkompeti mal-antikorp ittikkettat bl-enżimi oriġinarjament preżenti fis-sistema biex jorbot l-antiġen inkapsulat fuq it-trasportatur tal-fażi solida. L-antikorp marbut b'mod kompetittiv jinħasel bil-ħasil u finalment, is-sottostrat jiġi miżjud għall-iżvilupp tal-kulur. Huwa importanti li wieħed jinnota li r-riżultat tal-iżvilupp tal-kulur huwa inversament proporzjonali għall-ammont ta 'antiġen (jew antikorp) li għandu jiġi skopert.
L-ELISA tal-kompetizzjoni hija ftit aktar kumplessa mit-tliet metodi deskritti hawn fuq, iżda t-tliet tipi ELISA ta 'hawn fuq huma applikabbli fil-forma ta' ELISA tal-kompetizzjoni. Il-vantaġġ ewlieni tiegħu huwa li jista 'jsib kampjuni impuri u għandu riproduċibbiltà għolja tad-dejta, iżda għandu l-problema ta' sensittività u speċifiċità ġenerali fqira.
Riżultati pożittivi għal kontrolli negattivi
a. Kampjun, ir-reaġent huwa kkontaminat, jew operazzjoni ħażina meta żżid kampjuni twassal għal kontaminazzjoni inkroċjata billi tferrex soluzzjoni bejn bjar maġenb - ibdel ir-reaġenti u ħaddem bir-reqqa.
b. Il-pjanċa tal-enzima ma tinħaselx sewwa - ferra s-soluzzjoni tal-antikorp nadifa qabel taħsel il-pjanċa, u mbagħad ferra s-soluzzjoni tal-ħasil fuq il-bjar tal-pjanċa kollha biex tiżgura li tista 'tinħasel kompletament.
c. Ammont eċċessiv ta 'antikorp iwassal għal twaħħil mhux speċifiku - uża l-antikorp skond l-ammont rakkomandat fl-istruzzjonijiet u ħallat l-antikorp għall-konċentrazzjoni xierqa.
L-isfond ġenerali tal-pjanċa tal-enżima għolja
a. Twaħħil mhux speċifiku ta 'antikorpi - jiżgura li l-bjar huma magħluqa u li tintuża s-soluzzjoni ta' għeluq xierqa biex tipprevjeni t-twaħħil mhux speċifiku.
b. Konċentrazzjoni għolja ta 'rbit tas-sottostrat - iddilwa s-sottostrat b'mod xieraq.
c. Il-ħin ta 'reazzjoni huwa twil wisq - ittemm ir-reazzjoni b'soluzzjoni ta' terminazzjoni hekk kif il-pjanċa tkun żviluppat biżżejjed kulur għall-qari ta 'l-assorbiment u tqassar il-ħin ta' żvilupp b'mod xieraq.
d. Kontaminazzjoni tas-soluzzjoni tas-sottostrat - Is-soluzzjoni normali tas-sottostrat għandha tkun ċara u trasparenti, jekk jidhru kuluri isfar jew oħra, tindika kontaminazzjoni u għandha tiġi sostitwita b'soluzzjoni ta 'sottostrat ġdida.
e .L-inkubazzjoni tas-sottostrat mhix protetta mid-dawl - L-inkubazzjoni tas-sottostrat għandha titwettaq taħt kundizzjonijiet li ma fihomx dawl.
Ripetibbiltà fqira bejn il-bjar replikati
a. Il-kwantità tal-kampjun ELISA mhix pulita, u l-ħin ta 'spiking huwa twil jew qasir - ipprova żomm il-ħin ta' spiking qrib l-ewwel darba meta żżid bjar duplikati.
b. Volum bi spiked inkonsistenti - il-kampjuni għandhom jitħalltu sew qabel id-dilwizzjoni u għandha tintuża l-istess pipetta.
c. Kondizzjonijiet inkonsistenti tal-ħasil, operaturi - Meta tirrepeti l-kampjuni, il-kundizzjonijiet operattivi u l-persunal għandhom ikunu konsistenti kemm jista 'jkun mal-aħħar darba.
d. L-inkubazzjoni tas-sottostrat mhix protetta mid-dawl - L-inkubazzjoni tas-sottostrat għandha titwettaq taħt kundizzjonijiet li ma fihomx dawl.
