Клеточный скребок и клеточный подъемник
Клеточный скребок Vs. клеточный подъемник
Оба формата скребок для клеток и клеточный подъемник в основном используются для сбора клеток. Их лезвие предназначено для значительного уменьшения повреждения клеток и обеспечения доступа к поверхности роста. Лезвие обычно изготавливается из полимерного материала TPE, а рукоять обычно изготавливается из полимерного материала ABS. Эти материалы подходят для сбора клеток.
Сотовый подъемник в основном предназначен для использования в культура клеток блюда за его широкий скошенный край.
Скребок для клеток с наклонным вращающимся лезвием для легкого доступа к поверхности роста колб и чашек Петри.
Особенности клеточного скребка и клеточного подъемника
а. Для ручного сбора клеток.
b. Конструкция лезвия обеспечивает плавный контакт с поверхностью для роста, что приводит к минимальному повреждению клеток.
с. Гамма радиационная стерилизация.
d. Непирогенный, неэндотоксичный, нецитотоксичный.
e. Разная длина рукояток ножей соответствует требованиям для культивирования различных коллекций клеточных культур.
f. В индивидуальной упаковке.
g. Имеются лабораторные флаконы.
h. Доступны различные размеры: 18 см, 25 см, 40 см. мини-скребки для ячеек, и т.д.
i. Используется с планшетами для культивирования клеток, например, с планшетами для лунок. клеточный скребок для 24-луночного планшета, клеточный скребок для 12-луночного планшета, и т.д.
Применение клеточного скребка и клеточного подъемника
В фармацевтической промышленности, культура клеток стал важным компонентом продукции антител. Технология культивирования клеток использовалась для производства антител, связанных с ротавирусом, полиомиелитом, оспой, гепатитом, краснухой и ветряной оспой. Клеточные антитела против гриппа также были одобрены для использования в Соединенных Штатах и многих европейских странах. Вот несколько примеров клеточный соскоб & клеточный подъемник приложений.
Культивирование пассажей клеток
Рост и размножение клеток, растущих вплотную к стенке, затрудняются тем фактом, что после культивирования пространство в значительной степени насыщается влагой. колба или же культура в чашке Петри разрослась до однослойного покрытия. Культивирование пассажей клеток выполняется, чтобы обеспечить дальнейшее расширение или рост клеток. Кроме того, пассажные культуры служат для сохранения ячейка разновидность. Кроме того, различные клеточные эксперименты основаны на культивировании пассажей клеток.
Подвешенные клетки можно сразу разделить на бутылки, в то время как клетки со стенками необходимо переварить и провести другие обработки, прежде чем их можно будет разделить на бутылки. Трипсин обычно используется для расщепления прикрепленных клеток на отдельные клетки, а ЭДТА также может быть добавлена для улучшения пищеварения. ЭДТА представляет собой хелатор двухвалентных ионов, который ингибирует Ca2+ и Mg2+ на клеточной мембране. Обычно используемый раствор переваривания клеток обычно содержит 0.25% (масса/объем) трипсина и 0.03% (масса/объем) ЭДТА.
Во время эксперимента вы должны аспирировать супернатант клеточной культуры, промыть клетки PBS, отказаться от промывочного раствора и повторно добавить небольшое количество раствора для расщепления трипсин-ЭДТА. В зависимости от размера чашки для культивирования от 2 до 5 мл раствора для разложения достаточно, чтобы заполнить все дно чашки. Затем клетки наблюдают до тех пор, пока они не станут круглыми и не отделятся от стенки бутылки, что обычно занимает 3-5 минут. Во избежание слипания клеток не следует постукивать по колбе в процессе пищеварения. Для клеток, которые особенно трудно переваривать, можно добавить раствор трипсина и ЭДТА для расщепления, а затем поместить клетки при 37°C для облегчения переваривания. После отделения клеток от стенки флакона следует немедленно добавить полную среду, содержащую сыворотку, чтобы прервать пищеварение.
центрифуга Клетки культивируют при 800-1000 об/мин в течение 5 минут. Затем удаляют использованную среду, добавляют подходящую новую среду, осторожно перемешивают клетки и переносят их в новую культуральную колбу. Процент пассирования зависит от типа клеток. Трипсин может повредить клеточную мембрану некоторых клеток. В этом случае клетки можно осторожно соскоблить с мембраны с помощью... клеточный скребок, добавьте соответствующее количество среды, аккуратно продуйте, чтобы перемешать клетки, а затем пропустите их через культуру.
Экстракция клеточных белков
А. Подготовка к эксперименту
а. Подтвердите, что Генератор льда Убедитесь, что устройство включено и что имеется достаточное количество дробленого льда для использования во время работы.
б. Убедитесь, что льдогенератор включен и что в нем достаточно дробленого льда для использования во время работы.
c. Убедитесь, что ферментный маркер работает должным образом, запишитесь на прием и зарегистрируйтесь перед использованием.
d. Подготовьте 4 комплекта центрифужных пробирок объемом 1.5 мл. Они используются для сбора суспензии лизированных клеток, сбора белкового супернатанта после центрифугирования, определения концентрации белковых образцов после 5-кратного разведения и определения концентрации белковых образцов после 10-кратного разведения.
e. Приготовьте раствор для лизиса клеток.
Перед использованием смешайте раствор для лизиса клеток в соотношении 1 мл лизата: 10 мкл ингибитора протеазы (PMSF). PMSF действует в течение 30 минут, поэтому обратите внимание на готовый к применению препарат.
Заранее рассчитайте количество рабочей жидкости, которую необходимо подготовить. Конкретное количество рабочей жидкости необходимо определять в каждом конкретном случае. Вообще говоря, если клетки достигают 70–80% слияния в культуральной колбе на 25 Т, для использования требуется 250–350 мкл рабочего раствора. Если вы добавите слишком много раствора для лизиса клеток, концентрация белка в конечном образце может быть слишком низкой. Если добавлено недостаточное количество раствора для лизиса клеток, лизиса клеток недостаточно, и образец становится липким, легко блокируя наконечник пистолета на 200 мкл. Операционную жидкость для лизиса клеток рекомендуется предварительно охладить до 4°С.
f. Подготовить клеточные скребки и клеточные лифтеры. Не менее 3-х штук их для чередования при выскабливании клеток.
г. Подготовьте три стаканы Объемом 100 мл или более. Эти стаканы необходимо предварительно промыть и наполнить сверхчистой водой. Они используются для последовательной промывки использованных стаканов. клеточные скребки, И скребок для резиновых ячеек и пластиковый скребок для клеток имеются. Резиновый скребок для полицейских больше рекомендуется.
h. Приготовьте равновесный солевой раствор.
i. Подготовьте набор для определения концентрации белка методом BCA.
j. Подготовьте загрузочный буфер SDS. Он хранится при температуре -20℃ и должен быть открыт перед использованием.
Б. Экспериментальная процедура
а. Аккуратная столешница лабораторного стола
Независимо от того, какой эксперимент вы проводите, очень важно содержать операционный стол в чистоте и порядке. При проведении таких экспериментов, как экстракция белка или ДНК/РНК, рекомендуется работать на сверхчистом столе. При отсутствии сверхчистого стола мы должны позаботиться о том, чтобы операционный стол был максимально опрятным. Кроме того, поддерживать порядок на операционном столе — хорошая привычка, которую необходимо выработать перед любой экспериментальной операцией.
Когда подтвердятся необходимые лабораторные инструменты для эксперимента, клетки могут быть удалены из клеточного отсека.
б. Промывка фосфатно-солевым буфером (PBS).
После удаления клеток их следует промыть PBS при комнатной температуре. Затем все операции следует проводить на ледяной бане.
c. Клеточный лизис
Добавьте от 250 до 350 мкл лизирующего раствора в каждый флакон с клетками. Лизат следует хорошо распределить и лизировать на ледяной бане в течение 10 мин. Вы должны повторить, чтобы равномерно распределить лизат в течение этих 10 мин. Техника нанесения лизата такая же, как и при расщеплении трипсином. В ожидании лизиса следует подтвердить температуру центрифуги, термостата и водяной бани.
d. Соскабливание клеток
После завершения лизиса необходимо соскоблить клетки с помощью скребок для клеток. Каждое действие соскабливания клеток должно быть липким от лизирующего раствора, сохраняя одно направление сверху вниз, и действие похоже на соскабливание и мытье стекла.
e. Перенос образцов
С помощью пипетки объемом 200 мкл перенесите суспензию клеток, полученную путем соскабливания, в емкость объемом 1.5 мл. центрифужная пробирка (сразу после взятия образца) и многократно (30-60 раз) продуйте, чтобы полностью разрушить клетки. Старайтесь избегать образования пузырьков воздуха во время продувки. После завершения продувки центрифужную пробирку с образцом следует поместить на лед.
f. Повторите шаг e. для завершения сбора образцов.
Вам следует промыть скребок для клеток и клеточный подъемник используется на шаге д. в трех стаканах по очереди взболтать клеточные скребки аккуратно вставьте их на штатив для пробирок высушить. Если клеточные лифтеры не очищены, это может привести к перекрестному загрязнению образцов. Если клетки не высушиваются, это приводит к разбавлению образца.
g. Дальнейший лизис в ледяной бане
После того, как все образцы соскоблины и перенесены в центрифужные пробирки, их продолжают лизировать на ледяной бане в течение 5-10 мин. В течение этого периода необходимо повторно проверить состояние центрифуги, термостата и водяной бани.
h. Центрифугирование
После завершения лизиса центрифугировать при 12,000 4g, 5°C, в течение XNUMX мин.
i. Сбор белкового супернатанта
Возьмите супернатант и используйте его для подготовки образцов для измерения концентрации белка и денатурации для WB. При взятии супернатанта образца для WB запишите объем образца и добавьте соответствующий объем загрузочного буфера SDS впоследствии в соответствии с объемом образца, чтобы подготовить образец кулинарии.
C. Метод BCA для определения концентрации белка
а. Термостат следует предварительно прогреть до 37°C.
b. Приготовьте 5-кратный и 10-кратный растворы для количественного определения белка и после приготовления отложите их на льду. Рекомендуется использовать PBS для разведения образца, поскольку цвет D-Хэнкса может повлиять на конечный результат количественного определения концентрации белка.
5-кратное разведение: 80 мкл LPBS + 20 мкл супернатанта.
10-кратное разведение: 90 мкл LPBS + 10 мкл супернатанта.
c. Подготовьте набор для количественного определения белка BCA и рассчитайте необходимое общее количество рабочей жидкости. Подготовьте рабочую жидкость в соответствии с инструкцией в соотношении BCA:Cu = 50:1. Не забудьте тщательно перемешать жидкость. Полученный рабочий раствор имеет прозрачный светло-голубой цвет.
d. В каждую лунку 96-луночного планшета вносят по 20 мкл белка, при этом подготавливают не менее трех повторных лунок. Поскольку образец белка очень вязкий, а объем добавляемого белка невелик, наконечник шприца можно опустить в лунку и нанести белок на дно лунки, используя силу натяжения жидкости для завершения добавления белка.
e. После завершения добавления образца в каждую лунку с образцом добавляется 200 мкл рабочей жидкости. Добавление рабочей жидкости должно быть быстрым и чистым. Быстрое и чистое добавление рабочей жидкости способствует надлежащему перемешиванию.
f. Инкубировать в течение 30 мин при 37°C. После завершения реакции анализ должен быть завершен в течение 3–5 мин.
g. Абсорбция измеряется на заданной длине волны с помощью ферментного маркера.
h. Концентрацию белка следует рассчитывать по уравнению предварительно построенной стандартной кривой. Инструкции по построению стандартной кривой см. в инструкции к набору.
D. Денатурация образцов белка для вестерн-блоттинга.
а. Чтобы избежать сухого кипения, заранее нагрейте водяную баню до кипения и соблюдайте правила техники безопасности.
б. Используйте 5-кратный буфер для загрузки белка, хранящийся при -20°C, темно-синего цвета, и растворите его перед использованием.
c. В каждой группе образцов белкового супернатанта следует отдельно приготовить соответствующий объем буфера для загрузки (белковый супернатант: буфер = 4:1) и тщательно продуть.
d. Каждую пробирку с образцом следует закрепить взрывозащищенным зажимом, поместить в губчатый поплавок, денатурировать кипящей водой в течение 5 минут, охладить холодной водой в течение 1 минуты и повторить три раза, чтобы обеспечить полную денатурацию образцов белка.
e. Денатурированный белок должен быть равномерно синего цвета, прозрачным и бесцветным. Образец следует слегка центрифугировать, хранить при -20°C и отложить в сторону.
f. На этом этапе эксперимент завершен.
Как купить соскоб и клеточный подъемник?
Если вы заинтересованы в нашем Клеточный скребок и клеточный подъемник или есть какие-либо вопросы, пожалуйста, напишите по электронной почте info@antiteck.com, мы ответим вам как можно скорее.