Проточный цитометр
Что такое проточный цитометр?
Проточный цитометр устройство для автоматического анализа и сортировки клеток. Он может быстро измерять, сохранять и отображать ряд важных биофизических и биохимических характеристик рассеянных клеток, взвешенных в жидкости, и может классифицировать указанные подмножества клеток в соответствии с предварительно выбранным диапазоном параметров. Большинство проточных цитометров представляют собой приборы с нулевым разрешением, которые могут измерять только общее количество нуклеиновой кислоты, общий белок и другие показатели клетки, но не могут идентифицировать и определять количество нуклеиновой кислоты или белка в определенной части. Другими словами, он имеет нулевое разрешение деталей.
Принцип работы проточного цитометра
проточная цитометрия FACS
А. Принцип измерения параметров
Многопараметрическое измерение может выполняться одновременно проточной цитометрии, и информация в основном поступает из специфических сигналов флуоресценции и сигналов нефлуоресцентного рассеяния. Измерение проводится в зоне измерения, так называемой зоной измерения является точка вертикального пересечения луча лазера и луча потока жидкости, выбрасывающего сопло. Когда одиночная ячейка в центре потока жидкости проходит через область измерения, она облучается лазером и рассеивает свет во все пространство под телесным углом 2π. Длина волны рассеянного света равна длине волны падающего света. Интенсивность и пространственное распределение рассеянного света тесно связаны с размером, морфологией, плазматической мембраной и внутренней структурой клетки, поскольку эти биологические параметры связаны с оптическими свойствами клетки, такими как отражение и преломление света. Клетки, не подвергшиеся никаким повреждениям, обладают характерным светорассеянием, поэтому для анализа и сортировки живых клеток без окрашивания можно использовать различные сигналы рассеянного света. Сигнал рассеянного света фиксированных и окрашенных клеток, безусловно, отличается от сигнала живых клеток из-за измененных оптических свойств. Рассеянный свет связан не только с параметрами клетки как центра рассеяния, но и с такими абиотическими факторами, как угол рассеяния и телесный угол, под которым собирается рассеянный свет.
In проточной цитометрии обычно используются два вида рассеянного света: а. рассеяние под прямым углом (угол 0) (FSC); б. Боковое рассеяние (SSC), также известное как рассеяние под углом 90°. Упомянутый здесь угол относится к углу, примерно сформированному между направлением лазерного луча и осевым направлением трубки фотоумножителя, которая собирает сигнал рассеянного света. Вообще говоря, интенсивность света, рассеянного под прямым углом, связана с размером клеток и увеличивается с увеличением площади поперечного сечения клеток для одной и той же клеточной популяции. Опыты на живых сферических клетках показывают, что она в основном линейна при размере площади поперечного сечения в диапазоне малого телесного угла. Сложная форма и ориентация клетки могут быть самыми разными, на что особенно нужно обращать внимание. Измерение бокового рассеяния света в основном используется для получения информации о зернистых свойствах тонкой внутренней структуры клетки. Хотя боковой рассеянный свет также связан с размером и формой клетки, он более чувствителен к показателю преломления клеточной мембраны, цитоплазмы и ядерной мембраны, а также может давать чувствительный отклик на более крупные частицы в цитоплазма.
На практике прибор должен сначала измерить сигнал рассеяния света. При использовании в сочетании с флуоресцентными зондами анализ рассеяния света позволяет различать окрашенные и неокрашенные клетки в образце. Наиболее эффективное применение измерений рассеяния света заключается в идентификации определенных подгрупп из гетерогенных популяций. Сигнал флуоресценции в основном включает две части: а) спонтанная флуоресценция, то есть флуоресценция флуоресцентных молекул в клетке без флуоресцентного окрашивания после воздействия света. облучение; b. Характерная флуоресценция, то есть флуоресценция, испускаемая клетками после окрашивания в сочетании с флуоресцентным красителем под воздействием света; интенсивность флуоресценции слабая, а длина волны отличается от длины волны лазерного излучения. Сигнал автофлуоресценции является шумовым сигналом, который в большинстве случаев может мешать различению и измерению специфических сигналов флуоресценции. При проведении иммуноцитохимических измерений ключевым моментом является улучшение отношения сигнал/шум для флуоресцентных антител с низким уровнем связывания.
В целом, чем выше содержание молекул (например, рибофлавина, цитохрома и др.), способных вызывать аутофлуоресценцию в клеточных компонентах, тем сильнее аутофлуоресценция.
В целом, чем выше содержание молекул (например, рибофлавина, цитохрома и т. д.), способных вызывать автофлуоресценцию в клеточных компонентах, тем сильнее автофлуоресценция. Чем выше соотношение мертвых клеток к живым, тем сильнее автофлуоресценция. Чем выше доля ярких клеток в образце, тем сильнее автофлуоресценция. Основные меры по снижению помех от автофлуоресценции и улучшению отношения сигнал/шум следующие: а. По возможности выбирать яркие флуоресцентные красители; б. Выбирать соответствующий лазер и фильтр оптическая система; c. Фоновый вклад автофлуоресценции компенсируется электронной компенсационной схемой.
Б. Принцип разделения образцов
Функция сортировки проточный цитометр выполняется клеточным сортировщиком. Общий процесс таков: столб жидкости из сопла делится на серию мелких капель воды в соответствии с определенным параметром, выбранным логической схемой, чтобы определить, будут ли они отсортированы, а затем схема зарядки заряжает выбранные капли ячейки, заряженные капли переносят клетки через электростатическое поле и, отклоняясь, попадают в коллектор; Другие жидкости всасываются как отходы, а в некоторых типах инструментов также используются улавливающие трубки для сортировки.
Стабильная капля формируется за счет вибрации пьезоэлектрического кристалла на проточной камере под действием электрического сигнала в десятки кГц, который заставляет поток жидкости равномерно прерываться. Как правило, расстояние между каплями составляет около сотен мкм. Экспериментальная эмпирическая формула f=v/4.5d дает частоту сигнала колебаний стабильных капель воды. Где v — скорость потока жидкости, а d — диаметр отверстия сопла. Можно видеть, что использование различных отверстий и изменение скорости потока может изменить эффект сортировки. Отклонение отсортированных содержащих ячейки капель в электростатическом поле осуществляется зарядной цепью и отклоняющей пластиной. Напряжение зарядки обычно +150В или -150В; Разность потенциалов между отклоняющими пластинами составляет тысячи вольт. Генератор зарядных импульсов в зарядной цепи управляется логической схемой, поэтому от определения параметра до выбора логики до импульсной зарядки требуется период задержки, который обычно составляет десятки мс. Точное определение времени задержки является ключом к определению качества сортировки. Цифровая схема сдвигового регистра используется для генерации задержки. Его можно соответствующим образом отрегулировать в соответствии с конкретными требованиями.
Использование проточного цитометра
цитометрия
А. Тестирование и калибровка
Проточной цитометрии должны быть тщательно отрегулированы до и даже во время использования для обеспечения надежности и оптимальности работы. Основными элементами отладки являются интенсивность лазера, скорость потока жидкости и оптический путь зоны измерения.
Интенсивность лазера: в дополнение к регулировке угла зеркала для настройки лазерного луча на желаемую длину волны необходимо объединить кривую спектра на экране дисплея, чтобы максимизировать выходную интенсивность лазера.
Скорость потока жидкости: ее можно контролировать с помощью цифрового дисплея на операционном столе, а давление газа можно регулировать для получения стабильной скорости потока жидкости.
Регулировка светового пути области измерения: это ключ к отладке. Необходимо обеспечить, чтобы поток жидкости, лазерный луч, фотоэлектрическая система измерения рассеяния на 90° в зоне измерения были перпендикулярно ортогональны, а точка пересечения была небольшой. Как правило, это можно сделать в калибровке со стандартными флуоресцентными микросферами.
Количество, измеренное в проточной цитометрии, является относительным значением, поэтому необходимо откалибровать или откалибровать систему до или во время использования, чтобы можно было получить абсолютное значение посредством относительного измерения. Таким образом, калибровка в FCM выполняет двойную функцию: корректировка юстировки прибора и количественное масштабирование. СТАНДАРТНЫЙ образец должен быть стабильным, форма материального компонента должна быть относительно однородной и сферической по размеру, характеристики дисперсии образца должны быть хорошими, а экономия должна быть легкой. Стандартные флуоресцентные микросферы обычно используются в качестве небиологических стандартных образцов, а куриные эритроциты - в качестве биологических стандартных образцов. Микросферы изготовлены из полимерного материала и маркированы флуоресцеином или без него. Процесс подготовки используемого стандартного образца эритроцитов куриной крови был следующим: антикоагулянт куриной крови с 3.8% цитратом или гепарином (антикоагулянт: куриная кровь = 1:4) трижды промывали PBS, затем смешивали с 5 ~ 10 мл. 1.0% глутарового альдегида и промывали очищенными куриными эритроцитами после встряхивания при комнатной температуре в течение 24 часов. Наконец, его снова промывали PBS и хранили в холодильнике при 4℃ для последующего использования. Следует отметить, что без флуоресцентного окрашивания измеряемый световой сигнал представляет собой спонтанную флуоресценцию куриного гемоглобина.
Б. Эксплуатация и использование инструментов
а. Включите питание и прогрейте систему.
b. Откройте газовый клапан, отрегулируйте давление и получите необходимую скорость потока жидкости; включите систему охлаждения источника света.
c. Добавьте деионизированную воду в пробирку с образцом, промойте систему сопла.
d. Используя калибровочный стандартный образец, настройте прибор таким образом, чтобы интенсивность флуоресценции при рассеянии 0 и 90 градусов была максимальной, а коэффициент вариации — минимальным, исходя из мощности лазера, напряжения фотоумножителя и коэффициента усиления усилительной схемы.
e. Выбранная скорость потока, количество ячеек, параметры измерения и т. д., при одинаковых рабочих условиях для измерения образца и контрольного образца; одновременно выбирается режим отображения данных на экране компьютера, чтобы интуитивно понимать процесс измерения.
f. После измерения образца для промывки системы циркуляции жидкости используется деионизированная вода.
g. Поскольку экспериментальные данные хранятся на жестком диске компьютера (некоторые машины также имеют систему CD-ROM, поэтому объем памяти больше), вы можете закрыть газовый баллон и измерительное устройство и использовать только компьютер для обработки данных.
h. Распечатайте необходимые результаты.
C. Меры предосторожности при эксплуатации и использовании
а. Фотоумножитель требует стабильных условий работы. После воздействия сильного света ему требуется длительное время «темновой адаптации» для устранения или уменьшения части фонового тока, прежде чем он сможет работать. Также следует обратить внимание на магнитное экранирование.
б. Источник света нельзя включать и выключать на короткий промежуток времени (обычно около 1 часа); перед использованием источник света необходимо предварительно прогреть и убедиться в нормальной работе системы охлаждения.
c. Во избежание образования пузырьков жидкости необходимо постоянно поддерживать плавность потока жидкости в системе, а используемую жидкость для катетера следует фильтровать и дезинфицировать перед использованием.
d. Обратите внимание на выбор соответствующей системы фильтров и типа усилителя в зависимости от преобразования измеряемого объекта.
e. Особое внимание уделяется необходимости наличия контрольной группы для каждого измерения.
Как выбрать проточный цитометр?
Если вы заинтересованы в нашем Проточный цитометр или есть какие-либо вопросы, пожалуйста, напишите по электронной почте info@antiteck.com, мы ответим вам как можно скорее.